姜黄素对人肝星状细胞中神经生长因子及其低亲和力受体表达的影响

殷汉华，何雅军，韩馥缦，吕 霞，付 景，周文杰，舒建昌

1.广东省河源市中医院内三区，广东 河源517000;2.暨南大学医学院附属广州红十字会医院消化科

肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经途径，由多种因素所致的外界刺激引起各种细胞因子的释放，细胞因子-细胞-细胞外基质(ECM)间相互作用，最终使大量ECM 沉积于肝脏形成肝纤维化。其中，肝星状细胞(HSC)活化增殖，合成分泌各种细胞因子及细胞外信号转导通路蛋白，产生大量以胶原为主的ECM 成分，且合成多于降解，造成ECM 在肝内沉积，是肝纤维化形成的关键环节。姜黄素是中药姜黄的提取物，具有明确的抗纤维化作用。本研究旨在观察姜黄素对人HSC 株LX-2 中NGF 及其受体P75NTR表达的影响，从而探讨NGF 及P75NTR在姜黄素抗肝纤维化机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝星状细胞株LX-2，由美国Mount Sinai 医学院的Scott L. Friedman 教授馈赠;MTT、姜黄素、DMSO 购自美国Sigma 公司;DMEM 培养基干粉为美国Gibco 公司生产;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;兔抗神经生长因子多克隆抗体购自北京博奥森生物工程有限公司;兔抗P75NTR多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的复苏与培养:LX-2 于37 ℃快速复苏，接种于塑料培养瓶中，采用10%胎牛血清的DMEM 培养液，于37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养，待细胞长至80% ～90%密度时，用0.02% EDTA 和0.25%胰蛋白酶消化，以1∶4 传代。

1.2.2 姜黄素对人HSC 增殖的影响:取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2.0 ×105个/ml，细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μl，24 h 后加入无血清DMEM培养液培养24 h，使细胞同步化于休止期，弃上清，加入含不同浓度姜黄素(0、10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L)的DMEM 培养液，每组设4 个复孔，培养24 h后，弃上清，每孔加入200 μl 培养液和50 μl 现配的MTT 比色液，置培养箱中孵育4 h，去除培养液，加入150 μl DMSO 振荡溶解，酶标仪以参考波长630 nm、测量波长570 nm 测定吸光值。

1.2.3 细胞爬片的制备:取对数生长期细胞，以1.5×105/ml 密度滴加于提前处理好的置于六孔板内的盖玻片上，每孔滴加0.4 ml 细胞悬液，24 h 后加入无血清DMEM 培养液培养24 h，使细胞同步化于休止期，弃上清，分别加入含40 μmol/L 姜黄素以及正常的培养液，再培养24 h 后，弃上清，每孔加入4 ml PBS 洗涤玻片10 min×3 次，加入4%多聚甲醛2 ml 固定30 min，弃去固定液，每孔再加入4 ml 蒸馏水洗涤玻片10 min×3 次，捞出玻片置于玻片架，通风橱中至完全干燥，于-20℃冰箱保存待用。

1.2.4 细胞免疫化学染色:蒸馏水洗细胞爬片3 min×3 次;切片于0.01 mol/L 柠檬酸缓冲液中微波煮沸修复10 min，常温冷却，蒸馏水洗3 min ×3 次;0.3%H2O2甲醇液室温浸泡10 min，以灭活内源性过氧化物酶，PBS 洗3 min ×3 次;加正常山羊血清室温封闭20 min，以封闭非特异性抗原;弃去多余血清，分别滴加人鼠通用型兔抗NGF 多抗(1∶200 稀释)和人鼠通用型兔抗P75NTR多抗(1∶150 稀释)，湿盒内4 ℃过夜;次晨室温箱孵育30 min，PBS 洗5 min ×3 次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，于湿盒内室温孵育10 min，PBS 洗3 min×3 次，滴加50 μl 链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，湿盒内室温下10 min，PBS 洗3 min ×3 次，DAB显色，镜下控制显色时间，流水冲洗终止，苏木素复染，盐酸酒精稍分化，脱水透明，中性树脂封片，光镜下观察，阳性细胞为胞膜或胞浆呈棕黄色。以PBS 代替一抗作为阴性对照。结果判断:于200 ×光学显微镜视野下计数阳性细胞数比例，每张切片计数5 个视野。以阳性细胞百分数代表各个蛋白表达阳性率。

1.3 统计学分析 使用SPSS 13.0 统计软件进行分析，数据采用x-±s 表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，进行方差齐性检验，若各组总体方差齐同，采用Tukey(分组＞5)检验或Bonferroni(分组＜5)检验;若各组总体方差不齐同，采用Tamhane's T2 检验。P ＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对HSC 增殖的影响 不同浓度姜黄素与HSC 作用24 h 后，各组检测的吸光值如表1 所示。在30 ～80 μmol/L 浓度范围内，随着姜黄素剂量的增加，LX-2 的吸光值呈斜行直线下降(见图1)。

2.2 姜黄素对NGF 蛋白表达的影响 NGF 主要在胞浆及胞膜表达(见图2)。空白对照组中阳性表达率为(27.11 ±5.50)%，姜黄素作用于LX-2 后NGF 表达均有不同程度的升高，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0. 01)，其中以40 μmol/L 时表达率为最高(90.75 ±4.72)%(见表2)。

2.3 姜黄素对P75NTR蛋白表达的影响 P75NTR表达于胞浆及胞膜(见图3)，空白对照组中阳性表达率为(24.33 ±5.17)%，不同浓度姜黄素作用于LX-2 后表达率均升高，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)，其中以40 μmol/L 时表达率为最高(88.74 ±6.27)%(见表2)。

表1 不同浓度姜黄素对HSC 增殖的影响Tab 1 The effect of different concentration of curcumin on HSC proliferation

表2 姜黄素作用HSC 后NGF、P75NTR 表达的阳性细胞率(%)Tab 2 Effect of curcumin on expression of NGF and P75NTR of HSC (%)

3 讨论

姜黄素是从姜科姜黄属(Curcuma L1)植物姜黄、莪术、郁金等根茎中提取的一种天然酚类，被广泛用作色素、食品添加剂及调味品等，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除氧自由基以及对肾脏的保护、帮助肌肉损伤修复等多方面药理作用，既往多用于抗肿瘤研究中，近年来发现姜黄素具有良好的抗肝纤维化作用。

图1 MTT 法检测姜黄素对HSC 增殖的影响Fig 1 Effect of curcumin on HSC proliferation detected by MTT

图2 NGF 免疫细胞化学染色(200 ×) A:空白对照组;B:40 μmol/L 姜黄素组;图3 P75NTR免疫细胞化学染色(200 ×) A:空白对照组;B:40 μmol/L 姜黄素组Fig 2 Immunocytochemistry staining of NGF (200 ×) A:normal control group;B:40 μmol/L curcumin group;Fig 3 Immunocytochemistry staining of P75NTR(200 ×) A:normal control group;B:40 μmol/L curcumin group

我们研究小组既往的研究已分别在细胞和大鼠活体水平证实，姜黄素具有抗肝纤维化的作用，与其抑制HSC 增殖、诱导HSC 凋亡、抗脂质过氧化等机制有关［1-4］。本实验结果显示:一定浓度姜黄素(10 ～80 μmol/L)作用于人HSC 株LX-2 后，可使人HSC 的增殖明显减少，且呈剂量依赖性，与上述实验结果一致。

NGF 属于神经营养因子家族，最早在神经系统内发现，通过与低亲和力受体P75NTR和高亲和力酪氨酸激酶受体TrkA 结合发挥多种生物学作用，在神经系统的生长、分化、发育、再生与修复过程中意义重大。近期研究发现NGF 具有影响局部细胞的分化、增殖、迁移、凋亡和组织重建等作用［5-7］。对正常小鼠和部分肝切除小鼠的再生肝组织进行检测，发现再生肝组织中NGF 和P75NTR的mRNA 表达量高于正常肝组织;进一步分离肝细胞和HSC 检测发现，正常肝细胞中无NGF 和P75NTR表达，再生肝细胞中仅可检测到NGF;未活化的HSC 内仅能检测到少量NGF 和P75NTR表达，活化后两者表达量均明显升高［8］;在纤溶酶原缺乏的自发肝病小鼠模型中发现肝组织内P75NTR蛋白仅表达于HSC 中，且模型组表达较正常小鼠明显增加［9］;大鼠肝纤维化模型造模24 h 后NGF 表达量迅速上调，于48 h、72 h 后迅速下降，96 h 不再高表达，而P75NTR在肝纤维化过程中始终有表达［10-11］。野生型小鼠肝组织中HSC 凋亡率在无外源NGF 刺激时与P75NTR基因敲除小鼠无差异，但给予外源性NGF 后其凋亡率明显增加，而基因敲除小鼠中凋亡率无明显变化［9］，提示NGF 必须与P75NTR结合才能促进HSC 凋亡。NGF可能通过P75NTR参与诱导HSC 凋亡而发挥抗肝纤维化作用，具体机制尚未明确。

本实验采用体外培养人HSC 株LX-2 并给予不同浓度的姜黄素处理，对比观察各组HSC 中NGF、P75NTR表达量的变化。结果发现NGF 和P75NTR蛋白表达在姜黄素处理后均有明显增加，与空白对照组比较，差异有显著统计学意义，提示姜黄素可诱导HSC 表达NGF、P75NTR蛋白，该作用可能是姜黄素发挥抗肝纤维化作用的机制之一。而姜黄素具体通过哪些途径影响NGF 和P75NTR蛋白表达尚不清楚，有待进一步研究探讨。

［1］ Shu JC，He YJ，Lv X，et al. Effect of curcumin on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells ［J］. Braz J Med Biol Res，2009，42(12):1173-1178.

［2］ Shu JC，He YJ，Lv X，et al. Curcumin prevents liver fibrosis by inducing apoptosis and suppressing activation of hepatic stellate cells［J］. J Nat Med，2009，63(4):415-420.

［3］ Shu JC，Ye GR，Lv X，et al. Therapeutic effects of curcumin treatment on hepatic fibrosis ［J］. Chin J Hepatol，2007，15(10):753-757.舒建昌，叶国荣，吕霞，等. 姜黄素治疗肝纤维化及其作用机制的初步研究［J］. 中华肝脏病杂志，2007，15(10):753-757.

［4］ Lv X，Shu JC，Fu J，et al. Effects of curcumin on the expressions of leptin and adiponectin in human stellate cell strain LX-2［J］. Guangdong Medical Journal，2013，34(11):1641-1644.吕霞，舒建昌，付景，等. 姜黄素对人肝星状细胞株LX-2 瘦素和脂联素表达的影响［J］. 广东医学，2013，34(11):1641-1644.

［5］ Peters EM，Raap U，Welker P，et al. Neurotrophins act as neuroendocrine regulators of skin homeostasis in health and disease［J］. Horm Metab Res，2007，39(2):110-124.

［6］ Li JF，Shu JC，Chen LX，et al. Nerve growth factor promotes proliferation of hepatocytes in vitro via TrkANGFRsignal pathway［J］. Chinese Journal of Pathophysiology，2012，28(2):320-325.李俊峰，舒建昌，陈莲香，等. 神经生长因子通过TrkANGFR信号途径促进肝细胞增殖［J］. 中国病理生理杂志，2012，28(2):320-325.

［7］ Ratto MH，Leduc YA，Valderrama XP，et al. The nerve of ovulationinducing factor in semen［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(37):15042-15047.

［8］ Asai K，Tamakawa S，Yamamoto M，et al. Activated hepatic stellate cells over-express p75NTR after partial hepatectomy and undergo apoptosis on nerve growth factor stimulation［J］. Liver Int，2006，26(5):595-603.

［9］ Passino MA，Adams RA，Sikorski SL，et al. Regulation of hepatic stellate cell differentiation by the neurotrophin receptor p75NTR［J］.Science，2007，315(5820):1853-1856.

［10］ Chen X，Jiang HQ，Yang LT，et al. The expression of P75 in hepatic stellate cells of fibrotic human and rat liver［J］. Acta Anatomica Sinica，2006，37(1):66-68.陈新，姜慧卿，杨路亭，等. 神经生长因子低亲和力受体在肝纤维化患者和大鼠肝星状细胞的表达［J］. 解剖学报，2006，37(1):66-68.

［11］ Chen X，Jiang HQ，He ZG，et al. Increased expressions of NGF and its receptor P75 in liver of CCl4-induced toxic rats［J］. Basic＆Clinical Medicine，2007，27(7):802-805.陈新，姜慧卿，贺战国，等. NGF 及其受体P75 在四氯化碳中毒性大鼠肝组织中表达增强［J］. 基础医学与临床，2007，27(7):802-805.