新疆地区回族、汉族人群HHBBVV基因型的分布与特点

杨 柳，张红梅，徐娇阳，王 瑞，刘鸿春，王 铮，余伍忠新疆石河子大学医学院，新疆 石河子 83000；兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所,新疆 乌鲁木齐830000

乙型肝炎病毒（HBV）为部分双链环状DNA病毒，基因组长约3.2 Kb，主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌，是我国当前流行最广泛、危害最严重的一种传染病。HBV基因序列高度变异，主要与病毒本身生物学特性有关，根据全基因核苷酸序列异源性≥8%或S基因区核苷酸序列异源性≥4%，可将HBV分成8种（A-H）不同的基因型［1］，最近报道又新增了I型和J型［2-3］。大量证据表明，不同基因型的HBV的致病性存在差异，其基因型与乙型肝炎病情的进展、临床表现、治疗耐药、预后有着密切的关系。国内外研究均发现HBV基因型具有明显的地域性分布，在我国以C型和B型为主［4］。为此我们利用二代高通量测序平台对新疆乌鲁木齐和伊犁两地区的回族和汉族HBV患者进行检测，了解其基因型分布及与临床病情的相关性，现报告如下：

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清标本来源 200例HBV感染血清分别于2012年9月和2013年1月采自新疆伊犁地区人民医院和兰州军区乌鲁木齐总医院的门诊患者，包括回族94例，其中男性54例，年龄8～77岁，平均36.3±12.8岁，女性46例，年龄10～60岁，平均33.7±11.9岁；汉族100例，其中男性63例，年龄5～69岁，平均36.4±13.6岁，女性37例，年龄10～60岁，平均33.3±12.1岁。诊断符合2010年中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学分会联合修订的“慢性乙型肝炎防治指南”诊断标准［5］。采用ELISA方法筛选HBsAg阳性者，分离血清置-20℃冻存备检。所有病例血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均为阴性，且入选对象均来自无亲缘关系的回族、汉族人群，组间性别、年龄无显著差异。

1.2 方法

1.2.1 乙肝五项检测 HBV标记物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）检测严格按照酶联免疫吸附法试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）说明书操作。

1.2.2 HBV DNA定量检测 病毒DNA提取采用简易煮沸法：待检血清100 μl加至0.5 ml离心管中，加入100μl病毒提取液A，振荡混匀后13000r/min离心10min，吸弃上清，再加入25 μl提取液B，振荡混匀后100℃干浴10 min，13 000 r/min 离心10 min，上清2 μl立即用于FQ-PCR检测。实时荧光定量PCR严格按照试剂盒购自HBV定量PCR检测试剂盒购自艾康生物技术（杭州）有限公司。

1.2.3 HBV DNA基因分型检测 将HBV DNA定量检测后的标本200例，送天津华大健康科技有限公司进行序列检测，获得分型结果194例。

1.2.4 HBV DNA测序分型结果判读 根据HBV基因分型的标准：全基因组核苷酸序列差异≥8%或S基因序列差异≥4%，将HBV分为8个基因型，分别命名为AH。将检测的HBV的DNA序列与NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/view.cgi?db=2）上的参考序列比对以获得分型结果。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS 16.0软件处理，组间均值比较用单因素方差分析，样本率或构成比的比较采用χ2检验，其他采用四格表资料的Fisher确切概率法，以P<0.05判定有无统计学意义。

2 结果

2.1 新疆回族HBV感染者的分型结果及基因型与HBV-DNA含量的关系

HBV分型结果如图1示。共获得分型结果194例，其中回族94例，各基因型比例分别为：B型7例占7.44%，C型66例占70.21%，D型21例占22.34%。汉族100例，其各基因型比例分别为：B型23例占23%，C型57例占57%，D型12例占12%，B/C混合型8例占8%。未检测到其他型别。4种分型在汉族和回族中总体分布不同（P<0.001）。汉族和回族中均以C型占优势，但4种基因型在汉族和回族中的总体分布不同：C型和D型在回族的分布频率大于汉族，而B型和混合型在汉族中的分布频率大于回族。HBV基因定量检测结果显示，回族中D型HBV DNA的拷贝数最低，B型最高；汉族B/C混合型HBV DNA的拷贝数最低。回、汉族之间D基因型在HBV DNA拷贝数上有显著差异（表1）。

图1 HBV基因分型结果图（从左至右依次为B、C、D和B/C混合型）

表1 回族患者HBV基因型分布及HBV DNA拷贝数比较

2.2 基因型与不同性别、年龄患者的关系

统计回、汉族男女性别各基因型结果表明，在94例回族标本中，男性感染者B、C、D型分别为5（5/7）、37（37/66）、8（8/21）、女性感染者分别为2（2/7）、29（29/66）、13（13/21）；汉族100例标本中男性感染者B、C、D及B/C混合型分别14（14/23）、36（36/57）、8（8/12）、5（5/8），女性感染者分别为9（9/23）、21（21/57）、4（4/12）、3（3/8）。两民族基因型在性别上无明显差异（P>0.05）。将所检测的患者年龄划分为≤30岁、30～50岁和≥50岁3个时段，比较不同年龄段回、汉族HBV各基因型分布情况，发现年龄段在两民族间的分布不完全相同（χ2=19.579，P<0.01），≤30和≥50的比较有差异，即汉族中≤30岁的人数较多；30～50岁和≥50岁的比较有差异，即在汉族30～50岁间的分布较多，50岁以上患者分布最少（表2）。

表2 不同性别、年龄回族与汉族患者HBV基因型分布比较（n，×10-2）

2.3 不同类型HBV感染者基因型分布

回族94例中急性肝炎5例，无症状携带者22例，慢性乙型肝炎64例，肝硬化6例，肝细胞癌3例，其中有6例无症状携带者未分出型别。汉族100例中急性肝炎8例，无症状携带者3例，慢性乙型肝炎74例，肝硬化10例，肝细胞癌5例。通过对比显示，感染分型在回族和汉族4种分型分布无差异（P=0.175和P=0.983），即感染分型在两民族中分布均无统计学差异。5种临床类型在4种分型分布中无差异（P=0.229）。HBV基因型在不同类型HBV感染者中的分布相同。不同病情患者基因型分布情况（表3）。

表3 不同类型HBV感染者中HBV基因型分布

3 讨论

乙型肝炎病毒引起的是一种世界性疾病，由于人口素质和卫生环境状况的制约，在发展中国家的发病率明显增高。患者感染HBV后，可能逐渐演变为更为严重的肝病，如肝硬化、肝癌等，由此致使我国每年约50万人死亡，占全球因感染HBV导致肝衰、肝硬化、肝癌及并发症而死亡的总人数的一半，高达57.6%［6］。研究人员已经发现不同基因型HBV的传播途径和致病性存在差异，其基因型与乙型肝炎病情的进展、临床表现、治疗耐药、预后有着密切的关系。目前多个国家的相关研究已证实在临床参数中患者的人种和地理分布与HBV基因型之间的关联强度最为密切［7］。通过HBV基因分型研究可以了解人口迁移并能更好地描述HBV感染的地理分布特点。以往研究认为：A型主要见于欧洲、美国白种人和黑种人、非洲黑种人/南非、亚洲、印度；B型主要分布于中国大陆南部、中国台湾、越南、日本、美国亚裔；C型主要见于中国大陆北部、日本、中国台湾、中国香港、泰国、美国亚裔；D型主要分布于白种人（南欧）、阿拉伯人（北非及中东地区）及印度；E型见于非洲西部和中部；F型存在于中南美洲、美国土著居民、波利尼西亚；G型流行于中美洲、美国、越南、法国、德国；H型见于尼加拉瓜、墨西哥、美国；最近发现的I型在越南和老挝，J型在琉球群岛和日本。我国A、B、C、D等4个基因型都存在，北方城市以C基因型为主，由北至南，基因B型感染率逐渐升高，少数民族地区基因D型有较高的感染率［8］。

新疆自古以来就是一个多民族不断迁徙、融合、同化的多元文化区域，各民族杂居混居现象较为普遍，不同源人群在相同环境条件下，可以朝相同方向演化而形成趋同的体质特征。遗传物质DNA的核苷酸序列，在自然界以一定的频率发生变异。因此人群间的迁徙与混杂及血缘关系对基因频率是有影响的。新疆有十三个世居民族，回族是第四大民族，是典型的融生性民族，即回族源流的多元性与形成方式的融合性［9］。本研究HBV基因分型结果显示，新疆汉族C型显著高于B型，与文献报道一致［10］。回族94例HBV样品中，C型66例，D型21例，B型7例，未见基因型的重组，回族中C型占主导，其次D型也高达22.3%。明显高于杨少奇等宁夏地区回族HBV基因分型中D型占4.2%的报道［11］；同样与丽娜报道的新疆地区回族以B型为主D型次之，C型少见，且BC和CD混合型多见［12］；以及冯琴等研究的C型（71.43%），B型（14.29%），D型（7.14%）的结果都不一致［13］。出现这种差异我们认为首先是分型方法不同：目前用于HBV基因型分型的方法有多种，如基因序列测定法、聚合酶联反应-限制性片段长度多态性基因分型法、单克隆抗体ELISA基因分型法、基因型特异性引物PCR法、线性探针分析基因分型法和基因芯片法等。各种方法都有自己的优势和局限，杨少奇等采用限制性片段长度多态性酶切分型法及部分测序分型，PCR-RFLP法［14］可因酶切位点易受基因变异影响，遇混合感染或酶切不完全时，会出现复杂条带而影响结果判定。丽娜等采取基因型特异性引物巢式PCR法，由于选取的型特异性碱基聚集片段的保守性以及HBV DNA碱基变异等原因，会导致少数标本的扩增效应降低。在PCR过程中有时会出现污染等情况，形成非特异性条带而导致误判［15］；冯琴利用PCR反向斑点杂交法是一种较灵敏的快速检测HBV基因型的分子杂交的方法，但是该方法所选择的区段性检测准确性可能受到HBV基因突变的考验，同时其杂交区段过短，对于重组型的检测准确性也受到一定的质疑［16］。随着基因型概念的提出，测序成为主要鉴定基因型的方法，也是HBV基因分型的金标准和基础。全基因序列分析不仅可靠，在基因分型的同时还可以了解不同基因型和不同株间的其它基因结构特征［17］。本研究中，我们采用的是HBV DNA的直接测序法，通过设计上游和下游各1个引物来对整条序列进行测序，该方法虽然操作比较复杂，但准确度高。其次是地区差异：在排除检测方法学、试剂的灵敏度、特异性不同的基础上，可能与地区差异、病例选择、收集范围、样本数量不同有关。之前新疆地区少数民族HBV基因分型研究中回族样本量较少，来源也较局限，仅占研究民族中稀少比例，未做到回族人群的专项研究，不能准确的体现该族群HBV基因型的真实情况。本组标本来源于乌鲁木齐和伊犁两地，样本量较已有报道大幅增加，其结果的代表性更为广泛，反应了新疆少数民族HBV基因型的地域分布和种族分布特点。但我们仍需扩大不同地区间的样本量进行深入研究，进一步验证是否地域不同就是形成基因型频率差异的原因。

在杨少奇等［11］研究中纳入了肝功能检测指标作为肝脏损害评判指标，对宁夏回族HBV基因型分布进行研究，显示感染C基因型的患者肝脏损害较明显，并且与肝硬化、肝癌的关系更密切，而感染D基因型的患者肝脏损害较轻，预后可能较好。欧美研究表明，基因型D容易在较年轻的患者中发生原发性肝细胞癌，且D型与急性自限性肝炎相关。Oommen等［15］对249例慢性乙型肝炎儿童的研究发现，HBV DNA的高复制水平和基因型D密切相关。而国内童巧霞［20］等研究也显示，基因型与临床表型有关：基因型B、C及混合型在重型肝炎、肝硬化及肝癌患者中的分布存在差异，混合型和D基因型仅见于重型肝炎、肝硬化患者。上述研究与本研究结果不同，本研究显示，汉、回族中基因型在临床表型中分布相同。出现这种差异的原因主要有以下两点：（1）本研究涉及肝脏，而肝脏自我修复力较强，病情一般发展较慢，尤其病情较轻时，病情发展更慢甚至恢复，或可解释本研究出现的结果。且本研究中显示慢性肝炎占五种临床分型的绝对优势，占71.1%（P<0.001），也可佐证肝脏疾病一般发展较慢，多发展为慢性的情况；（2）致病性并不等同于临床表型，目前普遍认为［18-21］基因型C引起的炎性坏死及纤维化程度比B型更加严重，且C型与肝硬化和肝癌的关系更为密切，基因型C的累积生存率要明显低于B型。但这种致病性比较是否可以转化为临床表型比较，即具体基因型致病性与相应临床表型的关系，未有统一共识。虽然越来越多的证据表明基因型致病性与相应临床表型有关系，但要肯定具体基因型致病性与相应临床表型的关系，还必须开展更多研究，包括大样本的研究、短期及长期影响的研究、人群预后研究以及病理生理研究，以获得大量令人信服的结果来证实这种关系；（3）不排除地域差异、样本量、检测方法、感染分型的分类标准等造成的不同结果。所以参考以上文献并结合本研究对象的区域性特点，本研究结果可信，具有一定的科研价值，对于本地区流行病学资料也有一定补充。

总之，HBV基因型有着多种类型，目前研究人员对于HBV基因型的一些方面的认识还处于初级阶段，很多领域还需要进一步深入。但我们希望通过新疆少数民族地区HBV感染者基因分型的研究，能够对本地区HBV感染日常临床诊治工作、抗病毒治疗疗效相关性预测及慢性乙型肝炎患者个体化治疗等起着重要的指导意义。

［1］ La Torre G,Nicolotti N,de Waure C,et al.An assessment of the effect of hepatitis B vaccine in decreasing the amount of hepatitis B disease in Italy［J］.Virol J,2008,5(84):84.

［2］Olinger CM,Jutavijittum P,Hübschen JM,et al.Possible new hepatitis B virus genotype,Southeast Asia［J］.Emerg Infect Dis,2008,14(11):1777-80.

［3］ Tatematsu K,Tanaka Y,Kurbanov F,et al.A genetic variant of hepatitis B virus divergent from known human and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally assigned to new genotype J［J］.J Virol,2009,83(20):10538-47.

［4］ 谢碧霞,江家骥.HBV基因型、亚型及其临床关系［J］.中国人兽共患病学报,2006,22(12):1153-5.

［5］ 中华医学会肝病学分会.中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)［J］.中华肝脏病杂志,2011,19(1):13-24.

［6］ Liang X,Bi S,Yang W,et al.Epidemiological serosurvey of hepatitis B in China--declining HBV prevalence due to hepatitis B vaccination［J］.Vaccine,2009,27(47):6550-7.

［7］ 史鸣树,闵建荣.乙型病毒性肝炎［J］.2009:44.

［8］ Zeng G,Wang Z,Wen S,et al.Geographic distribution,virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in China［J］.J Viral Hepat,2005,12(6):609-17.

［9］ 谢小冬,陕雪梅.回族起源的DNA证据［J］.回族研究,2002(3):75-8.

［10］张红梅,杨 柳,桂俊豪,等.新疆维族、汉族人群HBV基因型的分布与特点［J］.现代预防医学,2013,40(7):1339-42.

［11］杨少奇,王战会,杨 力,等.回族乙型肝炎病毒基因型分布及其临床意义［J］.中华肝脏病杂志,2006,14(6):466-7.

［12］丽 娜,马玉霞,鲁晓擘,等.5种少数民族HBV基因型分布及其特点［J］.肝脏,2009,14(4):299-301.

［13］冯 琴,朱善军,刘秋梅,等.新疆克拉玛依汉族和维族慢性乙型肝炎患者HBV基因型研究［J］.医学检验与临床,2010,21(5):110-1.

［14］杨银辉.病毒基因分型方法的研究进展及应用［J］.中华检验医学杂志,2005,28(10):1102-4.

［15］Oommen PT,Wirth S,Wintermeyer P,et al.Relationship between viral load and genotypes of hepatitis B virus in children with chronic hepatitis B［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr,2006,43(3):342-7.

［16］Ali MM,Hasan F,Ahmad S,et al.Comparative evaluation of INNOLiPA HBV assay,direct DNA sequencing and subtractive PCRRFLP for genotyping of clinical HBV isolates［J］.Virol J,2010,7:111.

［17］Sanger F,Nicklen S,Coulson AR.DNA sequencing with chainterminating inhibitors［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1977,74(12):5463-7.

［18］Alexopoulou A,Dourakis SP.Genetic heterogeneity of hepatitis viruses and its clinical significance［J］.Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2005,4(1):47-55.

［19］Akuta N,Kumada H.Influence of hepatitis B virus genotypes on the response to antiviral therapies［J］.J Antimicrob Chemother,2005,55(2):139-42.

［20］童巧霞,吴艳艳,罗端德.湖北省地区乙型肝炎病毒基因分型及其临床意义［J］.临床内科杂志,2006,23(2):126-8.

［21］经继生,黄 培,阮成荣,等.江苏省乙型肝炎病毒基因型分布与临床相关性［J］.肝脏,2006,11(5):335-6.