樱桃叶黄酮的体外抗氧化活性

王垣芳， 修金霞， 赵 峰， 李祖成， 郑 珊

（1.滨州医学院 药学院，山东 烟台 264003；2.滨州医学院 烟台附属医院，山东 烟台 264003）

人体内自由基产生过多可导致组织细胞氧化损伤，诱发各种疾病、加速衰老[1]。来源于植物的黄酮类、苯酚类、多糖类等物质具有很强的抗氧化活性。因此，近年来从植物中挖掘具有实际应用价值的天然抗氧化剂已成为研究的热点之一。大量的研究表明，中草药来源的黄酮具有较强的抗氧化活性[2]，能有效地清除体内过多的自由基，防止脂质过氧化，保护细胞和线粒体的正常结构与功能，在预防和治疗自由基诱发的疾病和抗衰老方面具有广泛的应用前景[3-4]。

樱桃（Cerasus pseudocerasus L.）为蔷薇科李亚科的多年生木本植物，在我国分布极为广泛，其叶、根、核及鲜果皆可入药。樱桃叶味辛苦、性温、无毒，具有温胃、健脾、止血、解毒等功效，还能降压、治胃寒食积、腹泻、吐血、疮毒等病症[5]。研究表明，樱桃叶中含有丰富的黄酮类物质[6]，但对樱桃叶黄酮的抗氧化活性研究国内尚有限。作者采用碱提酸沉法从樱桃叶中提取总黄酮，考察其对羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用，对H2O2诱发小鼠红细胞氧化溶血及肝脂质过氧化的抑制作用，为樱桃叶黄酮的开发利用提供理论依据。

1 器材

1.1 主要仪器设备

KQ5200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司制造；TU-1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司制造；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司制造；Waters 600E高效液相色谱仪，美国Waters公司制造；电子天平，Metter-Toledo仪器公司制造；RE-52-05型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂制造；DL-5000B型低速冷冻多管离心机，上海安亭科学仪器厂制造；层析柱，盐城泓宇玻璃仪器厂制造。

1.2 材料与试剂

樱桃叶，初秋采自烟台市牟平区高陵镇；硫代巴比妥酸TBA，国药集团化学试剂有限公司产品；芦丁对照品，中国药品生物制品检定所提供；D101大孔吸附树脂，上海开平树脂有限公司产品；体积分数95%植物乙醇，以及石油醚、七水和硫酸亚铁、抗坏血酸、三氯乙酸、邻苯三酚、葡萄糖、邻二氮菲、无水乙醇，均为国产分析纯。

2 方法

2.1 樱桃叶黄酮的提取

取干燥的樱桃叶样品适量，粉碎，60目过筛。准确称取樱桃叶干粉约5 g，按料液比l g∶30 mL加入体积分数80%的乙醇150 mL，70℃回流浸提1.5 h后立即抽滤并收集滤液。将滤液转至蒸发瓶中，减压浓缩以除去提取溶剂。收集浓缩液转移至100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。然后将提取液以4 000 r/min的速度离心l0 min，除去叶绿素和其他水不溶性杂质，取上清液移至分液漏斗中，加入等体积的石油醚充分振荡，静置分层后分离收集下层液，即为样品提取液，反复萃取直至上层液（石油醚）为无色，冷冻干燥，即得樱桃叶粗黄酮干燥粉末。称取樱桃叶粗黄酮粉末0.1 g，用蒸馏水溶解，然后定容于100 mL的容量瓶中，得到1.0 mg/mL的樱桃叶粗黄酮溶液。详见文献[7]。

2.2 樱桃叶中黄酮含量测定

精密称取芦丁5 mg置于5 mL的量瓶中，配制成1 mg/mL的芦丁对照品储备溶液，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色体系，以 510 nm 波长比色法测定芦丁系列浓度对照溶液的吸光度，以浓度C为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程

取1.0 mL樱桃叶黄酮溶液，按上述方法显色后，以试剂空白作为参比液测定吸光度，根据芦丁直线回归方程计算出溶液中黄酮的含量。详见文献[8]。

2.3 樱桃叶黄酮的纯化及其溶液配制

选用D101大孔树脂对樱桃叶粗黄酮溶液进行纯化[9]。将上述1.0 mg/mL粗黄酮溶液pH值调为4.0，以每小时2倍体积的上样流量进行吸附，再用体积分数70%乙醇、3倍柱体积进行洗脱，洗脱流量为每小时2倍体积。收集洗脱液减压浓缩至浸膏，经真空干燥得到黄色粉末，加蒸馏水配制成1.0 mg/mL的樱桃叶黄酮溶液，作为样品储备液，并配制1.0mg/mL维生素C溶液的样品储备液。

2.4 樱桃叶黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用

取0.75 moL／L邻二氮菲溶液1 mL于试管中，加入 400 mmol／L 的 PBS（pH 7.4）缓冲液 2 mL 和蒸馏水1 mL，充分混匀后，加2.5 mmoL／L硫酸亚铁溶液1 mL，混匀，加 20 mmoL／L 的 H2O21 mL，置于37℃水浴1.5 h，在536 nm处测其吸光度，记作A1；用1 mL蒸馏水代替l mL H2O2，测得吸光度记作A2；用黄酮溶液1 mL代替1 mL蒸馏水，测得吸光度记作A3。按公式（2）计算OH·自由基清除率

2.5 樱桃叶黄酮对超氧阴离子（O2-·）的清除作用

于各试管中分别加入 0.05 mol／L Tris-HCl（pH 8.2）缓冲液4.6 mL，加入l.0 mL黄酮溶液，混匀，在25℃水浴10 min，取出后立即加入经25℃温浴的0.06 moL／L邻苯三酚溶液0.3 mL，对照管加入10 mmol／L的HCl 0.3 mL。各管充分混匀，准确反应3 min（加人邻苯三酚时开始计时）后加入质量分数5%维生素C溶液0.1 mL终止反应。10 min后，在420 nm处测定吸光度，记作A′1；对照管以1 mL蒸馏水代替待测样品，记作 A′2。 按公式（3）计算 O2-·清除率

2.6 樱桃叶黄酮对H2O2诱发小鼠红细胞氧化溶血的抑制作用

将受试小鼠断头取血，用肝素抗凝，2 000 r／min离心10 min得红细胞，用4倍量生理盐水洗涤并离心3次，然后用生理盐水稀释成质量分数0.5%的红细胞悬浮液备用。取红细胞悬浮液1 mL，加入100 mmol／L H2O2（空白管不加 H2O2）及黄酮溶液1 mL，37℃温浴1 h，加入4倍量生理盐水稀释，3 000 r／min离心6 min，取上清液于415 nm处测定吸光度，按公式（4）计算溶血抑制率

式（4）中：AC为加入样品后的H2O2诱导管的吸光度；AK为H2O2诱导管的吸光度；AD为不加H2O2的正常管的吸光度。

2.7 樱桃叶黄酮对小鼠肝组织脂质过氧化反应的抑制作用

按文献[10]方法，将受试小鼠颈椎脱臼后立即打开腹腔，从门静脉注入预冷的生理盐水冲洗后取出肝脏，称质量，按1 g∶9 mL的质量与体积比加人预冷的生理盐水，制成10 g/dL的肝匀浆液备用。取肝匀浆液1 mL加入试管中，分别加入0.5 mL不同质量浓度的樱桃叶黄酮溶液，空白对照加入等体积生理盐水，混匀后37℃温浴1 h，加入体积分数20%三氯乙酸溶液1 mL，混匀后再加质量分数0.7%的硫代巴比妥酸溶液1.5 mL，沸水浴15 min后3 000 r/min离心10 min，取上清液于波长532 nm处测定各管的吸光度A。按公式（5）计算抑制率

式（5）中： A′C为加入样品管的吸光度； A′K为体积分数60%乙醇管的吸光度；A′D为生理盐水管的吸光度。

3 结果

3.1 樱桃叶粗黄酮的提取及其含量

按照实验方法2.1，从5 g樱桃叶样品中提取粗黄酮0.28 g，产率为5.6%。按照实验方法2.2对樱桃叶粗黄酮纯化干燥后，得到黄酮干燥粉末0.18 g。

3.2 樱桃叶黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用

由图1可知，樱桃叶黄酮对·OH具有清除作用，且随着黄酮质量浓度的增加，其对·OH的消除作用逐渐增强，呈现较明显的质量浓度依赖性。在黄酮终质量浓度为 30 μg/mL时，清除率达到85.67%，其对·OH的清除能力优于维生素C。

图1 樱桃叶黄酮对·OH的清除作用Fig.1 Scavenging effect of cherry leaves flavonoids on free radicals·OH

3.3 樱桃叶黄酮对超氧阴离子（O2-·）的清除作用

从图2可知，不同质量浓度的樱桃叶黄酮对O2-·均具有清除作用，且随质量浓度增大，样品吸光度下降，对O2-·的清除率呈上升趋势，在终质量浓度为30 μg/mL时，清除率达到72.45%，其对O2-·的清除能力稍弱于维生素C。

3.4 樱桃叶黄酮对H2O2诱导小鼠红细胞溶血的抑制作用

小鼠红细胞悬液加入H2O2后吸光度值增大，表明H2O2可以氧化红细胞膜，导致红细胞溶血。从图3可以看出，随着樱桃叶黄酮质量浓度的增加，样品吸光度逐渐增加，对红细胞氧化溶血抑制率逐渐增加，当终质量浓度达到30 μg/mL时，其溶血抑制率为79.82%，其对H2O2诱导小鼠红细胞溶血的抑制率优于维生素C。

图2 樱桃叶黄酮对O2-·的清除作用Fig.2 Scavenging effect of cherry leaves flavonoids on free radicals O2-·

图3 樱桃叶黄酮对H2O2诱发小鼠红细胞氧化溶血的影响Fig.3 Inhibition of cherry leaves flavonoids on hydrogen peroxide-induced erythrocyte hemolysis

3.5 樱桃叶黄酮对肝匀浆脂质过氧化反应的影响

由图4可以看出，随着黄酮质量浓度的增加，样品吸光度逐渐增加，对肝脂质过氧化的抑制率相应增高，当终质量浓度为30 μg/mL时，抑制率可达75.54%，其对肝组织脂质过氧化反应的抑制与维生素C接近。

图4 樱桃叶黄酮对肝匀浆脂质过氧化反应的抑制作用Fig.4 Inhibition of cherry leaves flavonoids on lipid peroxidation of hepatic homogenate

4 讨论

·OH和O2-·等活性氧自由基可对机体产生一系列的损害，如损伤蛋白质的巯基和氨基，使蛋白质变性、交联，导致酶的活性丧失；损伤DNA，导致细胞突变；破坏多不饱和脂肪酸，导致生物膜结构和功能改变等。大量的研究表明，炎症、衰老、肿瘤等多种疾病的起因和发展都与自由基损伤和脂质过氧化有关[11-12]。因此，近年来寻找安全有效的天然抗氧化剂一直倍受医学界的关注。

本实验结果表明，樱桃叶黄酮能有效地清除·OH和O2-·，其活性呈现质量浓度依赖性，当樱桃叶总黄酮质量浓度达到30 μg/mL时，对·OH及对O2-·的清除率分别达到 85.67%和 72.45%，并且对·OH的清除能力优于维生素C，而对O2-·的清除能力稍弱于维生素C；樱桃叶黄酮对H2O2诱发小鼠红细胞氧化溶血的抑制率强于维生素C，当终质量浓度达到30 μg/mL时，其抑制率为79.82%；樱桃叶黄酮对肝脂质过氧化反应的抑制作用与维生素接近，当终质量浓度达到30μg/mL时，其抑制率为75.54%。

5 结语

本实验结果提示，樱桃叶黄酮具有较强的体外抗氧化活性，有可能具备防治自由基相关性疾病的天然抗氧化药物、保健品或食品抗氧化剂的开发潜力。

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