儿童脂肪干细胞与多种尿道生物支架相容性的对比研究＊

西安市儿童医院泌尿外科（西安710043） 幸世龙 马斌芳 张敬悌 白 明 葛文安

本文用体外脂肪干细胞复合培养来对多种尿道生物支架的相容性进行一些对比研究［1～4］，以期能够得到这些生物支架相容性的数据和结果，现报道如下。

材料与方法

1 材 料

1．1 设计：细胞学体外培养对比观察实验。

1．2 时间及地点：2012年12月至2013年12月在本院实验中心完成。

1．3 组织来源：所用脂肪组织来源于我院泌尿外科1～3岁鞘膜积液的5例患儿术中所取腹股沟区脂肪组织，1例为女性，4例为男性，供体无传染病及其他特殊疾病，平均脂肪吸取物大概为10ml。

2 实验方法

2．1 脂肪干细胞的分离、纯化、培养及传代：在无菌条件下，把脂肪组织用PBS反复冲洗，并用0．1%I型胶原酶在37℃的条件下消化60min，后用等体积高糖DMEM＋10%FBS中和酶活性，再用1100r／min离心5min。弃掉上清，重悬沉淀，200目筛网过滤，细胞悬液使用细胞记数板进行计数，按2×104／培养瓶接种于25cm2培养瓶中，在培养瓶内加入完全培养基，37℃、5%（体积分数）CO2孵箱培养，每3d换液1次。细胞培养至80%融合时，用胰酶／EDTA消化并按1∶1的比例传代［5］。

2．2 支架材料的制作：分别制作膀胱脱细胞基质（BAMG）、小肠粘膜下层组织（SIS）、脱细胞尿道海绵体基质。

2．3 脱细胞尿道海绵体基质制作：取用猪阴茎组织，将尿道海绵体基质分离出，用混合脱细胞液震荡处理14d，存储于2．5g／L氯霉素溶液内备用。

2．4 细胞-支架复合物的制作：消化第4代脂肪干细胞，制备细胞悬液，浓度为1×108／l，后将表面接种了0．2ml细胞悬液的生物支架材料放在12孔培养板内，静置4h后，把含10%胎牛血清的DMEM培养液加入到培养板内，置于37℃，5%CO2的培养箱中培育。使用倒置显微镜观察细胞在支架材料上粘附、生长、分裂情况。

2．5 细胞粘附率的计算：取24孔培养板，将10块生物支架材料放入孔内，大小为5mm×10mm×2mm，将5×107／L细胞悬液0．2ml滴到材料上，静置4h，后在培养箱复合培养4h，将细胞悬液换到已加培养液的另一培养板，把原培养板中溢出的细胞消化收集，用细胞计数板计数，获得流失细胞数；细胞与材料的复合物继续培养24h，轻轻晃动培养液，收集培养液中的细胞。

2．6 XTT比色法测定细胞增殖：取96孔板，把10块生物支架材料放入96孔培养板内，同时设置空白对照组10个孔。把5×107／L细胞悬液接种在生物材料商，复3孔，后放置培养箱培养7d，以主波长480 nm，参比波长630nm在酶标仪上比色，测定吸光度。

2．7 观察指标［6］：儿童脂肪干细胞接种于不同生物支架后的生长、增殖及粘附。

3 统计学方法 采用统计学软件SPSS 20．0进行分析，计量资料以±s表示，采用方差齐性分析与q检验；计数资料比较用χ2检验。P＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

1 倒置相差显微镜观察脂肪干细胞渗透情况在培养第7天，所有生物支架材料均有细胞生长。细胞呈圆形，无异常形态细胞，粘附较好，极少数脱落，说明脂肪干细胞能在上述3种生物支架材料上正常生长与增殖。

2 细胞黏附率 BAGM的3d、7d细胞黏附率分别为45．77%±12．76%，42．45%±10．56%，SIS的3d、7d细胞黏附率分别为37．39%±9．66%，36．33%±8．44%，脱细胞尿道海绵体基质的3d、7d细胞黏附率分别为30．34%±13．12%，31．01%±9．23%，三种生物支架材料的3d、7d细胞黏附率不完全相同，差异有统计学意义，P＜0．05；3d细胞黏附率两两比较，BAMG与脱细胞尿道海绵体基质差异有统计学意义，P＜0．05，而其他无明显差异，P＞0．05；7d细胞黏附率两两比较，BAMG脱细胞尿道海绵体基质差异有统计学意义，P＜0．05，而其他无明显差异，P＞0．05。

3 细胞活性的XTT法测定 各生物支架材料的A值随时间而增加，到第7天最高，结果显示各组A值差异无统计学意义，P＞0．05，见附表。

附表 3组生物支架材料与空白对照A值比较（n＝10）

讨 论

脂肪干细胞具有多向分化潜能，不仅能分化为传统的间充质细胞系，还具有向非间充质细胞横向分化。近年来在学术界得到了极大的重视，被运用于各种研究中。而作为良好的组织工程的种子细胞，它能够很好地填充细胞生物支架的孔隙，使得生物支架更加稳固，同时因为它的多向分化能力，生物支架的生理功能也更加完善，因此对脂肪干细胞与组织工程中各个材料相容性的研究也在广泛开展中。

尿道的修复一直以来是泌尿外科比较棘手的一个问题，传统的修补方法存在较多的问题，而近年来随着学科的广泛交叉，组织工程得到了极大的进步，多种新型支架材料，尤其是生物支架被开放出来，新型支架修复材料迅猛地发展，主要有以下几种：①天然细胞外基质；②细胞外基质衍生物1、I、等；③人工合成聚合物尽管能大规模生产满足临床及研究的需求，但由于组织相容性较差，目前已很少使用。而生物支架材料相比而言其独特的优势是：①具有较好的生物可降解性、相容性；②不引发免疫排斥反应；③无毒性、可塑性等。其中的一部分已经在临床或者动物实验中应用，但是这些材料的生物相容性没有得到应有的关注，因此作者才进行此次研究。

本次研究结果表明，在倒置相差显微镜的连续观察中，3种材料上的脂肪干细胞生长良好，没有出现明显的异常形态细胞，可见脂肪干细胞能够在这3种生物支架材料上顺利生长、增殖；在细胞黏附率的观察上，三种生物支架材料的3d、7d细胞黏附率不完全相同，差异有统计学意义（P＜0．05），其中，培养3d细胞黏附率两两比较，BAMG与脱细胞尿道海绵体基质差异有统计学意义（P＜0．05），而其他无明显差异（P＞0．05），培养7d细胞黏附率两两比较，BAMG与脱细胞尿道海绵体基质差异有统计学意义（P＜0．05），而其他无明显差异（P＞0．05）。这与冯超［8］等在天然及合成尿道重建支架材料的生物相容性及力学性能研究中部分结果相近。以上结果表明：3种生物支架材料的细胞活性无明显差异（P＞0．05），它们与脂肪干细胞有良好的组织相容性。从细胞黏附率来看，BAMG比脱细胞尿道海绵体基质黏附率高，具体原因尚不清楚，可能与BAMG的胶原结构更加完整有关系，需要进一步探索。

综上所述，3种生物支架材料与儿童脂肪干细胞的生物相容性都是能够接受的，干细胞能在其上正常生长、增殖，具有良好的形态，BAMG的细胞黏附率较脱细胞尿道海绵体基质更高，BAMG或是进行尿道修复的较佳生物支架材料。但是，虽然这3种生物支架材料与脂肪干细胞生物相容性是可以的，不过毕竟是体外混合培养，没有体内那么复杂的生理环境，不会受到各种激素与细胞因子等的影响，因此本实验依然只是尿道生物支架与脂肪干细胞相容性的初步工作，动物实验是十分必要的。另外，脂肪干细胞的安全性至今依然没有得到肯定的保证，如果在体内发生癌变，后果不堪设想，因此，脂肪干细胞与尿道生物支架的临床应用还任重而道远，希望广大同仁能够解决这一难题，使得尿道修复得到跨时代的进步。

［1］ 黄广林，满立波，李贵忠，等．组织工程管状材料修复长段尿道缺损的实验研究［J］．北京医学，2009，31（1）：4-6．

［2］ 郭 翔，赵 珩．三维支架材料与脂肪干细胞的生物相容性［J］．中国组织工程研究与临床康复，2011，15（38）：7080-7084．

［3］ 田 霖，孙筱放，刘海波，等．人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性［J］．中国组织工程，2012，16（32）：5946-5952．

［4］ 孙江维，王 东，孙海钰．人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性［J］．中国组织工程研究，2013，17（51）：8869-8874．

［5］ 陈光平，罗盛康，徐 翔，等．人脂肪干细胞体外增殖的安全性评价［J］．广东医学院学报，2009，27（2）：126-129．

［6］ 杨 柳，姜 南，徐扬阳，等．膨体聚四氟乙烯与人体脂肪干细胞的体外生物相容性［J］．中国组织工程研究，2014，18（12）：1932-1937．