反相细乳液交联法制备裂隙结构壳聚糖纳米粒

李夜平，徐 云，程晓农，吴士龙，刘宏飞

(1.江苏大学药学院，江苏镇江212013;2.江苏大学材料科学与工程学院，江苏镇江212013)

壳聚糖(Chitosan)化学名为聚(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D葡聚糖，是经甲壳素脱乙酰化的天然线性高分子，是自然界唯一碱性氨基多糖［1］.研究发现:壳聚糖具有良好的生物相容性、生物降解性、生物粘附性和降解产物无毒性等特点，同时壳聚糖还具有抑菌、抗肿瘤、降低血糖和胆固醇以及免疫促进等药理活性，因此，壳聚糖非常适合用作药物载体材料.其中壳聚糖纳米粒作为药物缓、控释制剂的载体，不仅可控制药物释放速率、减少给药次数、降低用药剂量，而且可增强药物稳定性、降低毒副作用，并实现药物在特定组织和器官的靶向可控释放，达到靶向治疗的目的［2-3］.

制备壳聚糖纳米粒的常用方法包括离子凝胶法和反相微乳法［4-5］，其中离子凝胶法制备条件温和，但所用溶液浓度很低，纳米粒子产率低下，同时纳米粒稳定性较差;而反相微乳法则需大量的表面活性剂和助表面活性剂，同时载体材料浓度和分散相/连续相体积比也必须很低时方可形成微乳液，因而导致产物后处理困难，纳米粒生产效率低.

细乳液法是近年来发展起来的一种制备聚合物纳米粒的新方法，该方法的优点在于体系中表面活性剂的浓度大大低于微乳液法.细乳液属热力学亚稳定体系，在表面活性剂和高效乳化条件下(如高剪切乳化，高压均质乳化，超声乳化)，乳液体系的分散相可被分散成亚微米的液滴，通过将分散相中的溶剂去除，即可得到纳米粒混悬剂.该方法常用于亲脂性聚合物(如乙交酯-丙交酯共聚物)纳米粒的制备［6］.也有少数采用油包水细乳液法制备亲水性聚合物纳米粒的报道［7-8］，但体系油水相体积比仍较高，否则产物团聚严重.此外，作为药物的载体材料，纳米粒若具有孔隙结构，将有利于提高载药量［9］.因此，本研究拟探讨采用反相细乳液法制备壳聚糖纳米粒的可行性，同时考察乳化时剪切速率、油水相体积比、乳化剂用量以及交联剂用量等对纳米粒粒径的影响.

1 试验

1.1 试 剂

壳聚糖(脱乙酰度90%)、液体石蜡、正己烷、Span-80、无水乙醚、异丙醇、冰醋酸和戊二醛(w=25%)购自国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇、石油醚和氢氧化钠购自成都科龙化工试剂厂.

1.2 裂隙结构壳聚糖纳米粒的制备

将一定量的Span-80溶于液体石蜡与正己烷的混合溶液(V液体石蜡∶V正己烷=4∶1)中，搅拌并缓慢加入适量的 1.0%壳聚糖醋酸溶液，转速 500 r·min-1乳化10 min，再高速剪切乳化 10 min，得到稳定的细乳液.将细乳液移入三口烧瓶，搅拌并向体系缓慢加入适量的戊二醛乙醚溶液(V戊二醛∶V乙醚=1∶3)，60℃恒温持续搅拌反应3 h.交联反应结束后将体系在搅拌下由40℃升温至70℃减压脱水(升温速率为1～2℃·min-1)，得壳聚糖纳米粒混悬液，离心，产物分别用石油醚和异丙醇清洗多次，充分除去残留液体石蜡和乳化剂，最后60℃真空干燥，即得分散良好的具有裂隙结构壳聚糖纳米粒.

1.3 样品表征

采用BI-9000高浓度激光粒度分布仪(美国布鲁克海文仪器公司)测定壳聚糖纳米粒的粒径及分布，溶剂选择无水乙醇;采用JSM-7001F场发射扫描电子显微镜(SEM，日本电子株式会社)观察样品的大小及形貌;采用Nicolet Avatar-370型傅里叶变换红外光谱分析仪(FT-IR，美国热电公司)测定样品官能团的变化;采用STA-499C综合热分析仪(德国耐池公司)表征样品的热性能，载气为氮气，升温速率为10℃·min-1.

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

交联剂戊二醛在油相中的溶解分散性直接影响产物壳聚糖纳米粒的粒径及分布.由于戊二醛水溶液在液体石蜡中不能迅速均匀分散，若直接采用戊二醛水溶液为交联剂，液体石蜡为油相，则产物有少量团聚，难以获得分散良好的壳聚糖纳米粒.试验发现，戊二醛的乙醚溶液可以溶解分散在液体石蜡与正己烷的混合溶剂中，经考察，本试验选用液体石蜡与正己烷的混合溶剂为油相，乙醚作为交联剂戊二醛的分散剂(V戊二醛∶V乙醚=1∶3)，得到的壳聚糖纳米粒分散性良好.

2.2 油水相体积比对粒径的影响

固定油水相总体积为60 mL，乳化剂Span-80质量为1.0 g，剪切速率为 10 000 r·min-1，交联剂溶液体积为3 mL，考察油水相体积比对壳聚糖纳米粒粒径的影响.通常在采用反相悬浮法制备壳聚糖微球时，为防止微球之间相互粘连，油相体积一般为水相体积的8～10倍［10］，但该体系经高速剪切乳化后，体系的稳定性差，难以获得均匀的壳聚糖纳米粒.当降低油水相体积比至3∶2～2∶3左右时，体系的稳定性高，其中油水相体积比为1∶1时，体系稳定性最高.由图1可见:当油水相体积比由2∶1减少到1∶1时，产物的粒径逐渐减小;当油水相体积比达到2∶3时，产物的粒径又有所增加.结果表明，体系经高剪切乳化后稳定性越高，则交联反应和脱水时壳聚糖液滴相互之间粘连合并就越少，所得纳米粒的粒径也越小.图2为油水相体积比为1∶1时产物粒径分布图，其平均粒径为291.7 nm，多聚分散系数为0.005，产物粒径分布窄.

图1 油水相体积比对粒径的影响

图2 粒径分布图

2.3 剪切速率对粒径的影响

固定油水相体积各为30 mL，乳化剂Span-80用量1.0 g，交联剂溶液体积3 mL，考察剪切速率对壳聚糖纳米粒粒径的影响，结果见图3.可知:试验范围内，随剪切速率增加，产物粒径逐渐减小，原因在于剪切速率越高，油水相受到的剪切力越大，水相和油相越易分散，所得细乳液的粒径也就越小，因此，脱水后粒子粒径也越小.

图3 剪切速率对粒径的影响

2.4 乳化剂用量对粒径的影响

固定油水相体积各为30 mL，剪切速率10 000 r·min-1，交联剂溶液体积3 mL，考察乳化剂用量对壳聚糖纳米粒粒径的影响，结果见图4.

图4 Span-80用量对粒径的影响

由图4可知:纳米粒粒径随Span-80用量的增加，先迅速减小，然后略有增加，当Span-80用量为1.0 g时纳米粒粒径最小.原因是乳化剂用量较低时，不能完全覆盖所有液滴表面，部分液滴碰撞时会相互合并，导致粒子粒径较大;当乳化剂用量较高时，虽然体系稳定性好，分散液滴不易合并，但此时油相黏度较大，剪切乳化时水相和油相分散效果降低，导致粒径略有增加.因此采用反相细乳液法制备壳聚糖纳米粒存在最佳乳化剂用量.

2.5 交联剂用量对粒径的影响

固定油水相体积各为30 mL，剪切速率为10 000 r·min-1，乳化剂 Span-80 用量为 1.0 g，考察交联剂用量对壳聚糖纳米粒粒径的影响，结果如图5所示.可见，随着戊二醛溶液用量增加，壳聚糖纳米粒的粒径逐渐减小，原因可能在于戊二醛用量越大，壳聚糖液滴表面交联固化的速率就越快，液滴相互之间碰撞合并的几率就越小，同时壳聚糖凝胶粒子内部间的结合也更紧密，粒子的分散程度也更好，因此脱水后粒子的粒径也更小.另外，随戊二醛溶液用量的增加，所得壳聚糖纳米粒的颜色也逐渐加深.

图5 戊二醛溶液用量对粒径的影响

2.6 SEM 观察

图6为壳聚糖纳米粒不同放大倍率SEM图.由图6可知:纳米粒粒径为(200±100)nm，分散性良好，该数值小于高浓度粒径分析仪测量的数据，原因可能是壳聚糖纳米粒在溶剂中存在少量团聚.纳米粒表面疏松多孔，存在明显的裂隙(见图6b).这可能是交联的壳聚糖微凝胶在真空脱水的情况下，凝胶表面水分迅速挥发，表面变硬，阻碍了微凝胶内部水分向粒子表面的迁移，在粒子的内部与表面之间形成很大的应力，造成硬化的粒子表面形成裂隙，内部的水分从而得以继续挥发，随着真空脱水的不断进行，裂隙结构不断向粒子内部扩展.该现象与湿粘土块在阳光下暴晒易形成裂隙结构的机理应该是一致的.

图6 壳聚糖纳米粒的SEM图

具有裂隙结构的壳聚糖纳米粒与光滑表面的壳聚糖纳米粒相比，将更有利于负载多种药物［9，11］，因此，在药物缓、控释制剂领域具有极大应用前景.

2.7 FT-IR 测定

壳聚糖与壳聚糖纳米粒红外光谱如图7所示.

图7 壳聚糖和壳聚糖纳米粒红外光谱图

壳聚糖纳米粒在1 649 cm-1处产生新吸收峰，对应于 Schiff碱 C═N键的伸缩振动，在2 931，1 405 cm-1处的吸收峰主要对应于CH2的不对称伸缩振动和弯曲振动，其强度增大表明体系中CH2基团增多.红外谱图表明壳聚糖和戊二醛发生了交联反应.其他主要吸收峰的归属分别如下:3 438 cm-1为壳聚糖中OH和NH的伸缩振动吸收峰;1 655，1 566 cm-1分别对应于酰胺Ⅰ谱带、酰胺Ⅱ谱带;1 384 cm-1为CH3的变形振动和CH的弯曲振动;1 067 cm-1为 C—O 的伸缩振动［12］.

2.8 热性能分析

图8为壳聚糖及其纳米粒的热性能分析图.

图8 热性能分析

由图8可知:从DSC曲线可以看出，壳聚糖纳米粒的放热峰(218.6℃)较壳聚糖的放热峰(310.3℃)明显降低，说明戊二醛交联的壳聚糖纳米粒更易受热分解;TG曲线也证明了这一点.这是由于乳化交联制备壳聚糖纳米粒时，壳聚糖的结晶结构被破坏［13］.此外，二者在60℃的吸热峰对应于体系中水的吸热挥发，壳聚糖纳米粒在109.4℃和397.6℃处的弱吸热峰则可能是粒子中残留的Span-80和液体石蜡所导致.

3 结论

1)以戊二醛为交联剂，采用反相细乳液技术结合真空脱水处理工艺，可制备出分散性好，粒径为(200±100)nm的裂隙结构壳聚糖纳米粒.

2)随剪切乳化速率的增大和交联剂用量的增加，壳聚糖纳米粒粒径逐渐减小;随乳化剂用量的增加，壳聚糖纳米粒粒径先迅速减小，然后又略有增大;油水相体积比在3∶2～2∶3范围内，获得的壳聚糖纳米粒粒径较小.

3)壳聚糖形成具有裂隙结构的纳米粒后，其热稳定性有所降低.

References)

［1］Guerrero S，Teijó C，Muniz E，et al.Characterization and in vivo evaluation of ketotifen-loaded chitosan microspheres［J］.Carbohydrate Polymers，2010，79(4):1006-1013.

［2］Trapani A，Sitterberg J，Bakowsky U，et al.The potential of glycol chitosan nanoparticles as carrier for low water soluble drugs［J］.International Journal of Pharmaceutics，2009，375(1/2):97-106.

［3］Grenha A，Grainger C，Dailey L A，et al.Chitosan nanoparticles are compatible with respiratory epithelial cells in vitro［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2007，31(2):73-84.

［4］Fan W，Yan W，Xu Z S，et al.Formation mechanism of monodisperse，low molecular weight chitosan nanoparticles by ionic gelation technique［J］.Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2012，90:21-27.

［5］Wu Y，Wang Y J，Luo G S，et al.Effect of solvents and precipitant on the properties of chitosan nanoparticles in a water-in-oil microemulsion and its lipase immobilization performance［J］.Bioresource Technology，2010，101(3):841-844.

［6］Lee E S，Park K H，Kang D M，et al.Protein complexed with chondroitin sulfate in poly(lactide-co-glycolide)microspheres［J］.Biomaterials，2007，28(17):2754-2762.

［7］李秉正，毛志怀.W/O细乳液的制备及淀粉纳米微球的合成［J］.中国农业大学学报，2012，17(2):144-149.Li Bingzheng，Mao Zhihuai.Preparation of W/O miniemulsion and synthesis of starch nanoparticles［J］.Jour-nal of China Agricultural University，2012，17(2):144-149.(in Chinese)

［8］Xu J，Ma L L，Liu Y，et al.Design and characterization of antitumor drug paclitaxel-loaded chitosan nanoparticles by W/O emulsions［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，50(2):438-443.

［9］Anglin E J，Cheng L Y，Freeman W R，et al.Porous silicon in drug delivery devices and materials［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2008，60(11):1266-1277.

［10］Patil S B，Sawant K K.Chitosan microspheres as a delivery system for nasal insuflation［J］.Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2011，84(2):384-389.

［11］Tan S，Wu Q X，Wang J，et al.Dynamic self-assembly synthesis and controlled release as drug vehicles of porous hollow silica nanoparticles［J］.Microporous and Mesoporous Materials，2011，142(2/3):601-608.

［12］董炎明，许聪义，汪剑炜，等.红外光谱法测定N-酰化壳聚糖的取代度［J］.中国科学:B辑，2001，31(2):153-160.Dong Yanming，Xu Congyi，Wang Jianwei，et al.Determination of N-acylation degree of chitosan by IR spectrophotometry［J］.Science in China:Series B，2001，31(2):153-160.(in Chinese)

［13］Bhat S K，Keshavayya J，Kulkarni V H，et al.Preparation and characterization of crosslinked chitosan microspheres for the colonic delivery of 5-fluorouracil［J］.Journal of Applied Polymer Science，2012，125(3):1736-1744.