分泌蛋白DKK1(Dickkopf-1)在非小细胞肺癌患者血清及组织中的表达及其意义

陈 娟，杨红忠

(湖南省长沙市中心医院呼吸科，湖南长沙 410008)

肺癌是常见的恶性肿瘤，是难治的实体瘤之一，死亡率在各类恶性肿瘤中居首位，发病率呈逐年上升趋势。5年生存率仅为13%，其中将近60%的患者不能手术，大部分腺癌对化疗、放疗不敏感。不能手术的非小细胞肺癌(non-small lung cancer ，NSCLC)治疗率很低［1］。由于与肺良性疾病鉴别较为困难，肺癌患者往往错过最佳治疗时期。提高肺癌患者生存的主要手段是早期诊断，早期治疗。血清肿瘤标志物(tumor marker，TM)的异常往往早于影像学的异常，对于无临床相关症状患者，任何一项标志物的异常都可能具有提示意义［2］。国外学者研究发现Dickkopf-1 (DKK1)是肝癌和食道癌患者血清及组织中新的生物标志物和治疗靶点［3-4］。本研究拟通过分析血清中DKK1 含量及组织中DKK1 表达情况，探讨DKK1 作为NSCLC 诊断和预后生物标志物的可能性。

1 材料与方法

1.1 NSCLC 癌患者血清标本

本研究纳入NSCLC 患者192 例，年龄范围28 ～79 岁，中位数56 岁，其中鳞癌79 例，腺癌97 例，其他16 例，包括:大细胞癌5 例，腺鳞癌4 例，多型性癌5 例，类癌2 例。NSCLC 患者来自于长沙市中心医院呼吸内科和胸外科2007年1 至2007年12月的初诊入院患者，所有病例都经病理学，影像学等确诊，病例资料记录完整。随访采集患者结局及术后生存时间等信息，患者失访或者因任意原因死亡在生存分析中均被作为删失数据。平均随访时间为42.1月(4 ～45月)。同时收集200 名健康志愿者血液标本。

1.2 血清DKK1 含量检测

采用美国R＆D 公司DKK1 酶联免疫试剂盒检测血清中DKK1 含量，操作依据试剂盒操作说明书进行。

1.3 血清CEA 和CYFRA 21-1 含量检测

CEA、CYFRA 21-1 采用化学发光分析技术，测定前所有试剂，样本恢复至室温，严格按照操作说明书进行测定。

1.4 NSCLC 癌组织标本

NSCLC 标本来自两个不同的研究对象群体。第一部分144 例NSCLC 标本采集至已经检测血清DKK1 含量的192 例NSCLC 患者。另一部分NSCLC 标本取自长沙中心医院募集的进行NSCLC组织免疫组化和长期生存关系分析的279 例NSCLC 癌患者。对患者总生存期，术后生存期等信息进行随访。评价随访时间为71. 8月(1 ～112月)。

1.5 DKK1 的免疫组化检测

高压抗原修复，采用EliVisionTMplus 二步法，一抗DKK1 工作浓度为1:400，以PBS 代替一抗作为阴性对照，DAB 显色，苏木素复染。用染色强度和阳性细胞百分比两项指标综合评价结果，染色强度评分:阴性=0 分，弱=1 分，中度=2 分，强=3 分;阳性细胞百分比评分:≤10%阳性细胞=0 分，≤25%阳性细胞=1 分，≤50% 阳性细胞=2 分，＞50%阳性细胞=3 分。染色强度和阳性细胞百分比总评分和为3 分为+，4 分为+ +，5 分以上为+ + +。

1.6 统计学方法

全部数据经SPSSl8.0 软件进行统计分析，计量贤料以均数±标准差表示。非连续变量采用率的形式表示.组间比较采用卡方检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 患者血清DKK1 含量

192 例NSCLC 患者血清中DKK1 含量为56.38±11.73 pg/mL，而200 名健康志愿者血清中DKK1含量为23.37 ±7.24 pg/mL，两组间有显著差异(P＜0.01)(图1A)。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC 曲线)分析表明诊断NSCLC 的最佳血清中DKK1 临界浓度为32.25 pg/mL，此时其敏感性为88.7 %，特异性为88.2 %(图1B)。特异性为100%时对应的DKK1 浓度为49.27 pg/mL，此时敏感性为44.4%。将NSCLC 患者DKK1 含量作柱状图(图1C)，可见NSCLC 患者血清DKK1 含量大多在30 pg/mL 和60 pg/mL 之间，其均值加标准差约为65 pg/mL(图1C)。将血清中DKK1 临界浓度设为65 pg/mL 时，NSCLC 诊断的特异性为100%，敏感性为17.7%。

2.2 血清DKK1、CEA 及CYFRA 21-1 含量的临床意义

血清中DKK1、CEA 及CYFRA 21-1 含量与NSCLC 患者临床参数之间的关系见表1。NSCLC 患者中血清CEA 浓度大于5 ng/mL，CYFRA 21-1 浓度大于30ng/mL 是被认为是阳性。高浓度CEA 和CYFRA 21-1 与NSCLC 晚期、淋巴结转移、远处转移、淋巴结侵袭、血管侵袭及嗜神经侵袭等有相关性(P ＜0. 05)。二变量相关分析表明，血清CEA 和CYFRA 21-1 浓度之间有显著相关性(相关系数，0.213;P =0. 009)，而血清DKK1 与CEA 或CYFRA 21-1 浓度之间无相关性。

卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)生存曲线显示血清DKK1 浓度可以预测患者预后，如无病生存期(P =0.033，图2A)和总生存期(P =0.032，图2B)。血清CEA 和血清CYFRA 21-1 浓度与患者无病生存期(P=0.008 和P ＜0.001)，总生存期(P =0.039 和P=0.002)相关。192 例患者中，有12 例患者2 个血清标志物含量升高，62 例患者1 个血清标志物含量升高。2 个血清标志物含量升高的患者预后最差，而三个血清标志物含量都没有升高的患者预后最好(P ＜0.001;图2C 和D)。

图1 血清DKK1 在NSCLC 患者中分布及诊断价值

表1 血清标志物与NSCLC 患者临床病理参数之间关系

图2 卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)生存曲线分析DKK1，CEA 及CYFRA 21-1 与患者生存期关系

2.3 144 例NSCLC 患者肿瘤组织中DKK1 表达情况

192 例NSCLC 患者中144 名患者进行了NSCLC 切除术，收集手术切除NSCLC 组织标本，免疫组化检测DKK1 表达情况。正常肺上皮组织中，DKK1 呈阴性或弱阳性表达，主要表达于正常肺上皮细胞(图3A，3B)。在NSCLC 细胞胞浆中DKK1呈中等或强阳性表达(图3C，3D)。144 例NSCLC患者中，49 (34%)例患者DKK1 呈阳性表达。DKK1 血清浓度与肿瘤组织DKK1 表达呈显著相关性(相关系数，0.395;P ＜0.001)。

本研究还分析了144 例NSCLC 组织中DKK1表达的临床意义(表2)。在NSCLC 远处转移、晚期、淋巴侵润及血管侵犯中DKK1 表达明显升高(P ＜0.05)。DKK1 表达阳性NSCLC 患者无病生存期(P =0.004;图4A)和总生存期(P =0.046;图4B)均低于DKK1 表达阴性NSCLC 患者。

2.4 265 例回顾性NSCLC 组织中DKK1 表达情况

为了进行长期生存分析，本研究分析了265 例回顾性NSCLC 组织中DKK1 表达情况。这些患者最长随访时间达108月，平均随访时间为72.7月。免疫组化分析表明有76 例(28.7%)NSCLC 组织标本DKK1 表达阳性。DKK1 表达还与初次诊断时NSCLC 存在远处转移有关(P =0.021)。单因素生存分析表明，DKK1 阳性NSCLC 患者预后较差(P =0.030)。多因素Cox 回归分析表明，DKK1 表达是预测NSCLC 预后的独立预测因子。

表2 NSCLC 组织中DKK1 表达与临床参数之间关系

图3 DKK1 在NSCLC 组织中的表达情况(×400)

图4 卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)生存曲线分析NSCLC 组织中DKK1 表达与患者生存期关系

3 讨论

DKKs 是分泌蛋白家族，在脊柱生物中主要包括4 个成员(DKK1 – DKK4)。本研究结果表明NSCLC 组中血清DKK1 浓度显著高于健康人群组，因此DKK1 可以作为NSCLC 血清标志物的候选分子。ROC 曲线分析表明血清DKK1 浓度为31.9 pg/mL 为预测NSCLC 的最佳阈值，此时其敏感性和特异性分别为87.6%和87.9%。当把阈值设为49.2pg/mL 时，敏感性为44.4%，特异性为100%。因此，低浓度血清DKK1 能够作为NSCLC 的生物标志物。如果DKK1 对NSCLC 具有特异性，这对临床上应用DKK1 作为NSCLC 诊断标志物是极为理想的条件。但是有研究报道在肺癌、食道癌、宫颈癌及子宫内膜癌中，血清DKK1 含量也增加［5，6］。因此DKK1 作为NSCLC 或者其他种类肿瘤的血清标志物时有其不足之处。此外，低阈值水平的DKK1 与患者无病生存期和总生存期之间无相关性。ROC曲线分析还表明，血清DKK1 浓度为65 pg/mL 也是NSCLC 诊断的一个有效阈值。当选用高浓度血阈值诊断NSCLC 时，血清DKK1 浓度与NSCLC 晚期临床特征和预后差存在相关性。因此，高浓度血清DKK1 值能够作为NSCLC 诊断标志物。

联合使用多种血清标志物比使用单一标志物诊断各组肿瘤更为有效［7］。2010年，《AJCC 癌症分期手册》(第七版)接受了肿瘤血清标志物CEA 和CYFRA 21-1 作为NSCLC 预后的特异性预测因子，在此之前一直没有血清生物标志物在临床实践中用于NSCLC 诊断［4］。因此，本研究也分析了患者CEA和CYFRA 21-1 含量变化情况。在192 名NSCLC 患者中，有20 (13. 1%)名患者血清CEA 值和14(9.2%)名患者CYFRA 21-1 值高于阈值。联合使用CEA 和CYFRA 21-1 能够更加有效的预测患者NSCLC 预后(P ＜0.001)。由于DKK1、CEA 及CYFRA 21-1 之间没有相关性，因此可以联合使用三者预测患者预后，联合使用三种血清标志物预测预后的敏感性为33.3%，高于单独使用三种标志物中的任一一种(DKK1，17.7%;CEA，13.1%;CA19-9，9.2%)。尤其是预后最差组患者(10 名)完全能够使用三种标志物预测。

本研究还发现血清DKK1 浓度与肿瘤组织DKK1 免疫组化得分存在显著相关性(相关系数:0.395;P ＜0.001)。而且可使用血清DKK1 含量与肿瘤组织DKK1 相对表达量预测NSCLC 患者预后。因此，血清DKK1 含量和组织DKK1 表达都可以预测患者预后。基于这一研究结果，在预测NSCLC 患者预后时可以只是用患者血清标本，无需取组织进行检测。但是血清DKK1 含量和组织DKK1 表达的相关系数大致为0. 4，这表明NSCLC 患者中血清DKK1 含量和组织DKK1 表达只是大体上相关。造成这一结果的原因可能有，肿瘤体积不一、肿瘤血管生成能力不一及DKK1 在肿瘤组织内的异质表达等。本研究结果表明，血清DKK1 浓度与肿瘤体积无相关性，因此，DKK1 的异质表达和血管生成程度等其他肿瘤生物特征影响了DKK1 的血清浓度。

总之，NSCLC 患者DKK1 血清浓度高于健康人群。血清低浓度阈值DKK1 能够作为NSCLC 诊断生物标志物，而高浓度阈值DKK1 可以作为预后预测标志物。血清DKK1 浓度升高与相应NSCLC 组织中DKK1 表达有显著相关性。本研究在2 个独立的研究群体中证实了肿瘤组织中DKK1 表达可以作为预后预测因子。因此，NSCLC 患者血清DKK1 含量升高，NSCLC 组织DKK1 表达增加可以用于NSCLC 胃癌诊断和预测NSCLC 患者结局。

［1］徐平，皮佳俐，刘媛媛，等. IGF-1 和IGFBP-3 在肺癌患者血清中的表达及临床意义［J］. 湖南师范大学学报(医学版)，2007;4(1):11-14.

［2］Zong C，Wu J，Wang C，et al. Chemiluminescence imaging immunoassay of multiple tumor markers for cancer screening［J］. Analytical chemistry，2012，84(5):2410-2415.

［3］Grossi F，Spizzo R，Bordo D，et al. Prognostic stratification of stage IIIA pN2 non-small cell lung cancer by hierarchical clustering analysis of tissue microarray immunostaining data:an Alpe Adria Thoracic Oncology Multidisciplinary Group study (ATOM 014)［J］. Journal of Thoracic Oncology，2010，5(9):1354-1360.

［4］Su H，Hu N，Yang H H，et al. Global gene expression profiling and validation in esophageal squamous cell carcinoma and its association with clinical phenotypes［J］. Clinical Cancer Research，2011，17(9):2955-2966.

［5］Le Sheng S，Huang G，Yu B，et al. Clinical significance and prognostic value of serum Dickkopf-1 concentrations in patients with lung cancer［J］. Clinical chemistry，2009，55(9):1656-1664.

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［7］Ray S，Reddy P J，Jain R，et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum:advances and challenges ahead［J］. Proteomics，2011，11(11):2139-2161.