白杨素抑制肺癌A549细胞系球形成细胞自我更性

冷 超，韦 兵，莫 靓，龙超众，冯耀光，贺大璞，王元星

(南华大学附属第一医院心胸外科，湖南 衡阳 421001)

蛋白激酶CK2(亦被称为酪蛋白激酶Ⅱ)是一种高度保守的丝氨酸-苏氨酸激酶［1］。CK2α 即CK2的催化亚单位高表达是人非小细胞肺癌患者预后不良的标志［2］。此外，在细胞系研究的证据表明，Hedgehog (Hh)信号调节肺癌细胞干细胞样特性;并有研究证实在非小细胞肺癌细胞和组织中存在Gli1 活化［3］。Zhang 等报道CK2α 抑制下调Hh/Gli信号通路抑制人肺癌干细胞样细胞功能［2］。白杨素是中药蜂胶的主要活性成分，已被证明具有抗肿瘤和CK2 抑制作用［4-6］。本文研究白杨素是否能具有抑制肺癌干细胞样特性的A549 细胞系球形成细胞自我更新作用以及其作用机制是否涉及下调CK2α 和Gli1 蛋白表达。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人非小细胞肺癌细胞系(A549)源于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)，购自上海中国科学院细胞库(中国上海市);并用添加10%热灭活胎牛血清，青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM/F12 培养基，置含5% CO2的37 ℃增湿的培养箱中培养和扩增。

1.2 肿瘤球形成法

参照刘飞等［7］报道的方法，用含添加物B27(Invitrogen)，20 ng/mL EGF(PeproTech)，10 ng/mL bFGF (PeproTech)0. 4% BSA (Invitrogen)，4 μg/mL 胰岛素(Invitrogen)、100U/mL 青霉素和100U/mL 链霉素的无血清培养基DMEM/F12 (Invitrogen)培养基调节细胞密度为1 ×104个细胞/孔，接种到6孔超低粘附培养板(Corning);每3 天添加1mL 新鲜培养基，培养6 天，收集球形成细胞，分散成单细胞悬液并再悬浮于新鲜培养基中进行传代培养。

为了研究白杨素(美国Sigma 公司)对球形成细胞自我更新的作用，用1 ×103个细胞/mL 的单细胞悬液接种24 孔超低粘附培养板，每孔1mL。不同浓度(10，20 和40.0 μM)的白杨素添加到培养基中。培养3 天，添加1.0mL 新鲜培养基，继续培养3 天，在显微镜(Nikon Eclipse TE2000-S)下计数肿瘤球数。肿瘤球形成率=每孔肿瘤球均数/每孔接种活细胞数(1000)×100%。

1.3 cDNA 转染

参照文献［2］的方法，pcDNA3. 1-CK2α 或对照pcDNA3.1-LacZ 质粒为美国OriGene Technologies公司(Rockville，MD，USA)产品，购自湖南科泰生物技术有限公司(中国长沙市)。细胞以105细胞/孔接种于6 孔细胞培养板中，按照产商说明书的操作步骤使用脂质体2000 转染试剂(Invitrogen)转染A549 球形成细胞。转染48 h 后，Western blot 分析检定转染效率。

1.4 Western blot 分析

参照文献［2］的方法，裂解细胞，制备细胞裂解物。Bradford 法测定蛋白含量。10% SDS-聚丙烯凝胶电泳分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)。使用的一抗包括:抗-CK2α (Millipore)、抗-Gli1(Cell Signaling)和抗β-actin (Sigma)抗体孵育PVDF 膜过夜。接着用过氧化氢酶连接的二抗孵育膜1 小时，根据厂商说明书的操作步骤，用增强化学发光仪(Amersham Biosciences)检测信号。

1.5 统计学分析

数据表示为3 次独立实验数据的均值±标准差(Mean±SD)。应用Windows 软件系统(SPSS Inc，Chicago，IL)的SPSS 13. 0 对所有数据进行分析。Student's t-检验用于比较各组间的差异。双侧检验，P 值＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人肺癌A549 球形成细胞具有自我更新能力

干细胞条件培养基悬浮培养法结果显示:A549细胞系能形成非粘附性肿瘤球(图1A)，称为球形成细胞。球形成细胞传代培养结果发现:分散的单个细胞能形成新肿瘤球，以第2 代球形成细胞的肿瘤球形成率最高(图1B)。提示:A549 球形成细胞具有自我更新能力。

图1 人肺腺癌A549 细胞系成球培养以及肿瘤球传代培养

2.2 ChR 抑制A549 球形成细胞自我更新

肿瘤球形成法结果证实:ChR(10、20 和40 μM)处理第2 代球形成细胞以浓度依赖方式缩小A549 肿瘤球体积和降低肿瘤球形成率(图2)。说明:ChR 有效抑制A549 细胞系球形成细胞自我更新。

图2 白杨素对A549 球形成细胞自我更新的影响

2.3 ChR 下调A549 球形成细胞的CK2α 和Gli1蛋白表达

Western blot 分析结果表明:ChR 明显下调A549 细胞系球形成细胞CK2α 和Gli1 蛋白表达(图3)。

图3 白杨素对A549 球形成细胞CK2α和Gli1 蛋白表达的影响

2.4 ChR 抑制A549 细胞系球形成细胞自我更新涉及下调CK2α

为了证明CK2α 是否调节Gli1 蛋白表达以及是否参与促成自我更新，我们使用pcDNA3. 1-CK2α或对照pcDNA3.1-LacZ 质粒转染A549 细胞系球形成细胞。正如所期望的那样，Western blot 检测发现CK2α 蛋白过表达，并升高Gli1 蛋白水平(图4)。肿瘤球形成法检测结果表明:pcDNA3.1-CK2α 转染导致A549 细胞系球形成细胞的肿瘤球形成率增高(图5)，并显著减弱ChR(20 μM)降低A549 细胞系球形成细胞肿瘤球形成率作用(图5)。

图4 pcDNA3.1-CK2α 转染联合白杨素处理对CK2α 和Gli1 蛋白表达的影响

图5 pcDNA3.1-CK2α 转染联合白杨素处理对A549 球形成细胞自我更新的影响

3 讨论

干细胞条件培养基悬浮培养法是在无血清的条件下，添加成分完全明确的生长因子代替血清，使其即满足细胞生长需要，同时又避免血清的诱导分化问题。Levina 等利用干细胞条件培养基悬浮培养法，从非小细胞肺癌H460 和A549 细胞系中富集获得肺癌干细胞样细胞［8］。我们的研究结果亦证实人肺癌A549 细胞系球形成细胞具有自我更新特性。

白杨素是中成药蜂胶的主要活性成分，广发存在于多种植物中［4］。现代药物药理学研究数据表明，白杨素具有多种生物活性，其肿瘤预防和治疗作用最为引人注目［5-6］。新近研究报道白杨素类似物8-溴-7-甲氧基白杨素具有抑制肝癌干细胞功能特性作用［9-11］。本文的研究结果显示:人肺癌A549 细胞系球形成细胞具有肺癌干细胞自我更新性质;并且，清楚地展示出白杨素以剂量依赖方式降低A549 球形成细胞的肿瘤球形成率。提示:白杨素具有抑制肺癌干细胞样细胞自我更新作用。

尽管人们已知白杨素为一种CK2 抑制剂［5］，然而，具我们所知，迄今为止白杨素通过抑制CK2 降低Gli1 转录因子表达抑制肺癌干细胞样特性作用尚无证据。本文的实验研究结果表明，白杨素同时下调A549 球形成细胞CK2α 和Gli1 蛋白表达。此外，高表达CK2α 导致Gli1 蛋白表达上调，并能有效减弱白杨素降低A549 球形成细胞的肿瘤球形成率。这些结果为诠释白杨素通过抑制CK2 阻断Hh信号传导减低A549 细胞系球形成细胞自我更新能力提供了证据。

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