2D-HPLC-LVI测定人血浆中的利福平

李 威，邱细敏，郭思维，王 琼

(湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410006)

结核是一种世界性的传染性疾病，每年引起数万人死亡，其中死亡人数最多的主要是在发展中国家，尤其是在亚洲［1］。近年来，尽管全球结核发病率正在下降，但耐药性也正在迅速发展和蔓延［2］。利福平(Rifampicin，RFP)是经典有效的一线药物，但RFP 因诱导肝脏微粒体氧化酶［3-4］、个体差异大、生物利用度变化大［2，5-6］等缺点，使其在血液中的浓度或高或低，导致一系列的不良后果，如耐药菌的产生、治疗的失败、治疗疗程的延长、严重的肝损害以及对其它药物产生影响［7-8］。因此，通过测定RFP血药浓度来调整给药剂量以维持RFP 的有效血药浓度已经变得非常重要。

目前有一些高效液相色谱法［3，9-11］用于人血浆中RFP 的测定，但这些方法样品处理复杂、成本高、干扰多，不适于用于RFP 长期的血药浓度监测。与以往方法比较，本文采用2D-HPLC-LVI 法测定人血浆中的RFP，具有样品处理简单、无需内标、结果准确度高和自动化程度高等优点，适于临床RFP 血药浓度监测。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

2D-HPLC-LVI (large volμme injection，LVI)系统主要由萃取系统和分析系统两部分组成。萃取系统主要负责样品富集和初级去除杂质;分析系统主要负责样品的分离监测;中间接口采用“中心切割”的柱柱转换模式。整个系统主要由日本岛津高效液相色谱仪组成，包括2 个LC-10AT 单元泵(Pump1和Pump2)、LC-10ATvp 四元低压色谱泵(Pump3)、SIL-10ADvp 自进样器、SPD-10Avp 检测器、500 μL定量环和1 个六通阀;另外离心机为HS145 型(长沙安莱科分析仪器有限公司)，电子天平(AND GH-202，十万分之一，日本)。

1.2 试剂

RFP(含量＞99. 0%，批号:130496200501)。维生素C(含量＞99.7%)。特丁基对苯二酚(TBHQ，含量＞99.0%)。色谱纯:甲醇、乙腈;分析纯:磷酸二氢铵，磷酸;自制蒸馏水，空白血浆(中南大学湘雅二医院血液科)，所有试剂经过检测，无干扰。

2 方法与结果

2.1 对照品储备液和质控品的配制

精密称取RFP 对照品200.0 mg，置于25 mL 棕色容量瓶中，加适量含0.5 mol/LTBHQ 的乙腈超声溶解，并用含0.5 mol/L TBHQ 的乙腈定容，混匀，置于-20℃的冰箱保存，即得浓度为8.0 mg/mL 的RFP 储备液。使用时用甲醇溶液稀释成所需浓度的工作液。

取相同体积的空白血浆加入相同体积不同浓度的工作液，配制成低(0.4 μg/mL)、中(6.0 μg/mL)和高(16.0 μg/mL)3 个浓度的质控品。所有质控品置于-70℃保存。

2.2 血样的处理

精密吸取0.3 mL 血浆于含30 μL2.8 mol/mL维生素C 和0.6 mL 乙腈的EP 管，涡旋震荡1. 0 min，再在14500 r/min 离心8 min，取上清液100 μL进样。

2.3 色谱条件

辅助液是2.0 mmol/L 磷酸溶液(pH =3.00)。萃取流动相:84 mmol/mL 磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH 值为3.32)-乙腈-甲醇=55∶24∶21。分析流动相:42 mmol/mL 磷酸二氢铵溶液(pH =4.60)-乙腈-甲醇=48∶38∶14。样品经乙腈蛋白沉淀处理后，100 μL 上清液在PΜMP1 和PΜMP2 条件下进入萃取柱，并在PΜMP2 下，实现在线样品萃取除杂;接着在PΜMP2 条件下，采用“中心切割”模式将目标物转移到自制C18陷阱柱;最后用六通阀连接陷阱柱和分析柱，完成目标物的分离检测。柱温40℃，检测波长333 nm，进样量100 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 色谱行为和方法专属性 RFP 保留时间tR为9.80 min，色谱峰宽为0.55 min，通过萃取柱及分析柱的两级分离后色谱峰在tR±2.5 min 内无其他干扰峰(图1)。另外，目标物在萃取柱和分析柱之间转移时造成5.5 min ～6.5 min 之间的溶剂峰。

2.4.2 线性关系考察 精密吸取RFP 标准工作液，加空白血浆配制成浓度为0.2、0.6、2. 0、8.00、14.0、20. 00 μg/mL 的RFP 标准曲线样品，再按“2.2”项下步骤操作处理。结果RFP 在0. 20 ～20.00 μg/mL 呈良好的线性关系，以浓度为自变量(X)，峰面积为因变量(Y)，其回归方程为y =114716.4x-2533.8，R2=0.9999。

2.4.3 最低定量限考察 最低定量限(LLOQ)以RFP 色谱峰完全达到基线分离，峰面积RSD ≤20%，准确度在80% ～120%来计算。结果血浆中RFP 的最低定量限分别为0.12 μg、mL，完全满足临床RFP 的治疗药物检测要求。

2.4.4 绝对回收率考察 取低、中、高3 个浓度的RFP 质控品(n =6)，按“2.2”项下操作处理。所得峰面积与对应相同浓度的同样处理的RFP 对照品溶液所的峰面积进行比较，其结果如表2。

2.4.5 准确度和精密度考察 取低、中、高3 个浓度的RFP 质控品，按“2.2”项下操作处理。日内精密度数据通过日内测定RFP 标准血样低、中、高3个浓度得到(n=6)，日间精密度数据通过连续测定3 d 高、中、低3 个浓度，每日每个浓度6 份得到，其结果如表1。

图1 A. 空白血浆;B. 对照品+空白血浆(14.0μg/mL);

表1 方法的回收率、精密度和准确度

2.4.6 稳定性考察 取低、中、高3 个浓度的RIF质控样品和经处理的质控品，分别于室温放置0h、2h 和4h，4℃放置0h、12h 和24h，-20℃放置0d、7d和14d 后，按“2.2”项下操作处理(除经处理的质控品外)。另外，于-20℃冷冻保存24 h 后室温下解冻测定，连续3 次。结果表明血浆中的RIF 在实验条件下稳定性良好，符合治疗药物监测的要求。

2.5 临床样品的测定

本方法已成功用于RFP 口服剂量为0.45g 的15 例病人的血药浓度监测。在给药2 h 后进行样品采集，并且在2 h 内完成分析检测或者在被分析之前保存在-70℃。测定的浓度结果范围在1.25 ～13.8 μg/mL。

3 讨论

3.1 适合于日常治疗药物监测

近年来，许多文献报道了测定血浆中各种药物浓度的柱切换HPLC 法［12-14］。相比这些方法，本方法具有2 大特点:①具有聚焦体系，通过在特定时间内改变流动相来使分析物以“塞状”进入色谱柱，从而减小由大体积进样的峰扩散引起的误差。②引入了1 根陷阱柱，使该系统具备2 次除杂的能力。另外，该方法的自动化程度高，样品只需经乙腈蛋白沉淀处理。统计不同检测人员的测试结果发现:不同检测人员操作引入的误差被控制在5%以内。因此，无需内标校正，该系统也能获得很好的精密度、准确度和重复性。

3.2 大体积进样

为了满足临床上RFP 的检测要求，本方法通过采用LVI 来提高方法的灵敏度。实验考察了进样体积为100 μL、200 μL 和500 μL 时的方法最低定量限，结果见图2。当进样体积为500 μL 时，方法的最低定量限为0.03 μg/mL。但实验发现:随着进样体积的增加，萃取柱的寿命缩短，因此，在满足测定要求的前提下，尽可能选择小体积的进样量。当进样量为100μL 时，方法的最低定量限是0. 12μg/mL。

图2 进样体积为100μL、200μL 和500μL 最低定量限的色谱图

3.3 色谱条件的优化

鉴于RFP 分子结构式的特点，实验考察了Venusil SCX 和XtimateC18两种色谱柱。经过测试，选择柱效较好的XtimateC18柱作为分析柱，同时将Venusil SCX 柱作为萃取柱，使两者构成具有强抗干扰能力的二维色谱体系。对于陷阱柱，实验同样测试了自制SCX 柱和自制C18柱，结果:相对于自制SCX柱，自制C18柱更强的除杂能力。因此，本文将Venusil SCX 柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)，自制C18柱(10 mm ×4.6 mm，5 μm)和Xtimate C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)分别作为系统的萃取柱、陷阱柱和分析柱。为了尽量缩短保留时间和使峰变得尖锐，聚焦液、萃取流动相和分析流动相的流速分别是2.0 mL/min、1.0 mL/min 和1.2 mL/min。

3.4 血样的处理

实验早期，样品用纯乙腈进行沉淀，但发现RFP峰面积随着放置的时间越长变的越小，同时其后出现一个未知的、随时间越来越大的色谱峰。有文献报道［2］RFP 血样在-20℃或室温容易被氧化。因此本文在RFP 血样和标准溶液中分别加入了一定量的抗氧化剂维生素C 和特丁基对苯二酚(易溶于有机溶剂)，以确保其检测期间的稳定性。

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