MMP-9蛋白及mRNA在乳腺癌组织中的表达

杨 扬，段华新

(湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院，湖南 长沙 410005)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌的病因尚未完全阐明，诊断其浸润、转移及预后的指标尚需进一步研究。它的侵袭、转移是一个多因素参与、多步骤完成的复杂过程，而基质金属蛋白酶家族(matrix metallop roteinases，MMPS)对细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤细胞侵袭、转移的关键，其中基质金属蛋白酶-9 (MMP-9 )是最重要的酶类。在肿瘤生长、浸润和转移过程中起着关键性的作用。本文从蛋白水平及mRNA 水平研究MMP-9 在乳腺癌中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取湖南省人民医院2012 ～2014年诊治的乳腺癌患者45 例，均为女性作为一组。病理活检均为浸润性导管癌，其中28 例有淋巴结转移，17 例无淋巴结转移，均行乳腺癌根治术或改良根治术，术前均未经任何治疗;乳腺良性病变20 例作为对照组，病理活检为乳腺纤维腺瘤14 例，纤维囊性乳腺病6 例。标本分两份，一份经10% 中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续4 μm 切片，供常规HE 染色和免疫组化染色;一份迅速投入液氮中速冻，然后置于－70℃的冰箱保存备用。

1.2 免疫组化染色检测

应用免疫组化方法检测乳腺癌组及对照组组织中MMP-9 的表达(兔抗人MMP-9 单克隆抗体、免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥公司)，MMP-9 单克隆抗体工作浓度为1∶100，AEC 显色，用PBS 缓冲液代替一抗作为空白对照，用已知MMP-9 阳性乳腺癌切片作阳性对照(北京中杉金桥公司提供)。肿瘤细胞胞浆中出现红色颗粒即为阳性细胞。对免疫组化染色结果进行半定量分析，按照细胞着色的程度分成:阳性细胞数＜10% 为(－)，阳性细胞数10% ～25%为(+)，25% ～50% (++)，＞50%为(+++)。

1.3 RT-PCR 检测

1.3.1 引物设计

MMP-9 引物设计参照文献［1］合成，上游引物序列:5'-GAGGAATACCTGTACCGCTATG-3'，下游引物序列:5'-CAAACCGAGTTGGAACCAC-3';β 肌动蛋白(β-actin)上游引物序列:5'-AAGGACTGCTACGTCGG-3'，下游引物序列:5'-CCTGCCATGTATGTCGCT-3'。PCR 扩增片段分别为531 bp 和258 bp，由上海生物工程技术有限公司合成。

1.3. 2 总RNA 提取

用Trizol(Invitrogen 公司)提取乳腺癌组及对照组组织中的总RNA 后，用紫外分光光度计测总RNA 的A260/A280，比值在1.8 ～2.0 之间，说明纯度良好;取2 μL RNA 在1.5%琼脂糖凝胶电泳以检测RNA 的完整性。

1.3.3 DNA 的合成

20μL 逆转录反应体系中包括样品总RNA 2 ～4 μg，Oligo(dT)18 1μL，10 mmol/L dNTP mix 2μL，M-MLV 逆转录酶1μL(MBI)，RNA 抑制酶1μL，5×反应缓冲液4μL 和DEPC 处理水9 ～10μL，反应条件为42℃1 h，然后70℃灭活10 min。

1.3.4 PCR 扩增

以cDNA 为模板，扩增目的基因片断，β-actin作为内参照物。PCR 反应MMP-9 和β-actin 引物在同一EP 管中进行。其中cDNA2.5μL，TaqDNA 聚合酶0. 5μL，上游引物0. 4μL，下游引物0. 4μL，dNTP0.5μL，MgCl22.0μL，10 ×反应缓冲液2.5μL，加去离子水构建为总体积25μL 的反应体系。PCR反应条件:95℃预变性3 min，94℃40s，58℃40 s，72℃40 s，35 个循环，72℃延伸5 min。PCR 扩增后取5μL 扩增产物，进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行凝胶电泳分析。紫外灯下观察结果、拍照，在电脑凝胶成像系统中分析电泳带的灰度，用MMP-9/β-actin 的比值表示MMP-9 的相对表达水平。

1.4 统计学处理

应用SPSS13.0 统计软件对所获得的数据统计分析，数据以mean±SD 表示，各表达指标的组间差异在进行方差齐性检验后，采用t 检验或近似t 检验，计数资料的比较采用卡方检验，P ＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 MMP-9 在乳腺不同病变组织中的表达

MMP-9 在乳腺癌细胞的胞膜和(或)胞质呈阳性表达，在肿瘤细胞膜上出现弥漫且较强的红色(图1)。由表1 可见，乳腺癌组中的阳性表达率为80%，对照组MMP-9 阳性表达率为20%。乳腺癌组MMP-9 的表达率显著高于对照组(P ＜0.05)。

表1 MMP-9 在乳腺不同病变组织中的表达

图1 A.MMP-9 在乳腺纤维腺瘤中阴性表达(×400);B. MMP-9 在乳腺癌中阳性表达(×400)

2.2 乳腺癌组织和对照组织中MMP-9mRNA 和β-actin 扩增电泳结果

表2、图2 结果显示，MMP-9mRNA 在二组均有表达，乳腺癌组平均表达水平为0.9142 ±0.1081高于对照组表达平均水平为0. 3794 ±0.0428，两组比较差异有统计学意义(P ＜0. 01 )。

表2 二组织中MMP-9mRNA 水平比较

图2 乳腺癌组织和对照组织中MMP-9mRNA和β-actin 扩增电泳结果

3 讨论

基质金属蛋白酶(MMPs)是指一系列生理情况下可降解细胞外基质(ECM)及基底膜的内肽酶总称，通常由纤维母细胞、中性白细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞产生。MMPs 是一族锌离子依赖性蛋白水解酶，目前发现有23 种，它们是参与细胞外基质代谢的主要酶类，在肿瘤发生发展过程中，MMP 常过度表达，在肿瘤侵袭转移的过程中，此类蛋白酶(尤其以MMP-2，MMP-9)起了非常重要的作用。MMPs可降解ECM 而形成肿瘤细胞转移的通道［2］。MMPs不但可以降解基底膜和肿瘤组织周边的细胞外基质，并且能够促进血管的生成，这些作用为肿瘤的生长、局部侵袭乃至远处转移创造了有利的条件，因此MMPs 的存在被认为对于恶性肿瘤而言具有重大的意义。

基质金属蛋白酶-9 (MMP-9 )是MMPs 家族中最重要的酶类，在肿瘤的发生转移过程中起着重要作用。如Scott 等［3］通过RT-PCR 检测到MMP-9 mRNA 在皮肤角质细胞肿瘤的发生、发展过程中表达升高且参与肿瘤的侵袭转移，而Sajani 等［4］通过RNA 干扰技术抑制MMP-9 基因的表达则能抑制肿瘤生长，减少肿瘤的转移。王祥军［5］等采用免疫组织化学法，检测50 例乳腺癌及20 例癌旁正常组织中MMP-9 蛋白的表达情况，结果发现乳腺癌组织中MMP-9 的阳性表达率为66% (33 /50)，显著高于癌旁组织。

本研究采用免疫组织化学和RT-PCR 进行检测，一方面在大多数恶性肿瘤中MMP-9 除来自肿瘤细胞本身以外主要来自间质细胞，尤其是成纤维细胞，两种不同的细胞同时表达MMP-9，这为免疫组化检测MMP-9 的表达的结果评价带来一定的困难;另一方面，在很多情况下，蛋白质的变化与基因表达并不一致，故在本研究中还采用RT-PCR 检测整个肿瘤组织包括间质成分中MMP-9 mRNA 的相对表达量，更能如实地反映MMP-9 的表达水平，更易于评价。本研究免疫组化结果显示，在乳腺癌组织中MMP-9 蛋白的表达显著高于乳腺纤维瘤组织，RTPCR 的结果也表明MMP-9 mRNA 在乳腺癌中的表达显著高于对照组。本实验应用灵敏度高很高的RT-PCR 检测乳腺癌患者组织切片中MMP-9 mRNA的表达，较之免疫组化技术大大提高了检出率。总之，MMP-9 表达的测定可作为乳腺癌浸润转移的重要分子学标志物，选择针对MMP-9 作为靶点的靶向治疗，来降低乳腺癌侵袭和转移可能为乳腺癌综合治疗提供一种新的途径。

［1］Yang JM，Xu Z，Wu H，et al. Over expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in multidrug resistant cancer cells［J］.Molecular Cancer Res，2003，1(6):420-427.

［2］Bisson C，Blacher S，Polette M，et al. Restricted expression of membrane type 1-matrix metalloproteinase by myofibroblasts adjacent to human breast cancer cells［J］. Int J Cancer，2003，105 (1):7-13.

［3］Scott KA，Arnott CH，Robinson SC，et al. TNF-alpha regulates epithelial expression of MMP-9 and integrin alphavbeta6 during tumour promotion. A role for TNF-alpha in keratinocyte migration［J］. Oncogene，2004，23(41):6954-6966.

［4］Lakka SS，Gondi CS，Yanamandra N，et al. Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion，tumor growth and angiogenesis［J］. Oncogene，2004，23(27):4681-4689.

［5］王祥军，周士福，时伟峰，等.CD147 和MMP-9 在乳腺浸润性导管癌中的表达及其相关性［J］.实用癌症杂志，2009，24(2):141-143.