阿霉素致扩张型心肌病心肌损伤中各项相关指标变化

胡沙雅，何学华，阮 涛，罗建红，袁勇华

(湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院，湖南 长沙 410005)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是蒽环类抗肿瘤药物，为一种广谱抗肿瘤抗生素，临床上广泛用于治疗各种恶性肿瘤，对于急性白血病的疗效显著［1］，但由于阿霉素具有明显的心肌毒性，故其在应用上受到了极大的限制［2-3］。有调查表明，儿童肿瘤长期存活患儿存在心功能异常患儿中有87.7%有接受过阿霉素治疗，于是这类药物的心脏毒性是成为临床上非常棘手的问题。在大鼠模型上，其可以诱导扩张型心肌病的形成，使心功能下降，甚至出现心衰，有学者研究表明左旋甲状腺片［4］、福辛普利与卡维地洛联合治疗［5］等有一定疗效，但最终无法逆转心功能变化。于是众多学者通过大量研究明确其发病机制来达到彻底治愈的目的，目前认为氧自由基和心肌细胞凋亡在阿霉素致心肌损伤过程中发挥极其重要的作用，但当前尚无一种公认的理论来阐述其引发心脏毒性的作用机制，因此，临床上缺少有效的预防措施，本研究试图通过阿霉素诱导心肌细胞凋亡方面来阐述阿霉素致心脏毒性机制。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性SD 大鼠60 只(购于湘雅动物实验中心)，阿霉素(浙江海正药业股份有限公司)，大鼠血浆脑钠素(BNP)ELISA 试剂盒(上海锐聪实验室设备有限公司)，p53 抗体(博士德)，β-actin(Abgent 公司)，预染蛋白Marker(MBI 公司)，PVDF 膜(Millipore 公司)。

1.2 方法

1.2.1 扩张型心肌病模型建立 将SD 大鼠随机分成两组，分别为生理盐水组(n =20)和阿霉素组(n=40)。阿霉素组于每周根据大鼠体重腹腔注射阿霉素2.0mg/kg·周，生理盐水组则注射等量生理盐水，一共用药8 周，停药观察4 周。

1.2.2 模型评估 每周记录两组大鼠的体重及观察大鼠的状态及死亡情况。于第3、12 周分别随机取5 只生理盐水组及阿霉素组大鼠用水合氯醛按300mg/kg 行腹腔注射麻醉后行超声心动图检查，记录大鼠左室射血分数LVEF;于第12 周将生理盐水组和阿霉素组大鼠左心室取全血静置30min 后离心分离血浆，按试剂盒说明检测BNP。于第12 周对生理盐水组和阿霉素组大鼠处死后，迅速打开胸腔取出部分左心室心肌组织，用10%多聚甲醛固定后进行切片HE 染色。

1.2.3 凋亡指标p53 的检测 通过Western blot 技术检测造模前后SD 大鼠心肌组织凋亡指标P53 蛋白表达量。提取心肌组织蛋白，测定蛋白浓度;配制分离胶及浓缩胶，将提取的蛋白上样后进行电泳，当染料进入分离胶时，将原定电压80V 转为120V 进行转膜(条件350mA 电流转1.5 h)，封闭，抗体孵育(一抗稀释为1∶500，二抗稀释为1∶2000)，显影。

1.3 统计分析

采用SPSS11.5 软件对数据进行统计分析本文结果均用mean ±SD 表示，两组数据间比较用两样本t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生理盐水组和阿霉素组大鼠体重变化、死亡率及病理改变

造模前两组大鼠体重无差异;给药后1 ～3 周模型组大鼠逐渐出现躁动，体重与生理盐水组无明显差异;第4 周开始，阿霉素组出现毛色欠光泽、懒动、少食、腹泻、脱毛等症状，体重不增，甚至出现逐渐下降，部分大鼠出现腹水。第12 周末阿霉素组大鼠体重(296 ±11.97)g 明显低于生理盐水组(400 ±18.10)g，P ＜0.01，差异有统计学意义。阿霉素组大鼠于给药第6 周开始出现第一只大鼠因腹水死亡，至造模第12 周共死亡8 只，死亡率为20%，生理盐水组大鼠全部存活。阿霉素组心肌组织病理改变(HE染色)见图1。

图1 二组大鼠心肌组织病理改变(×200 倍)

2.2 二组大鼠超声心动图检查结果(LVEF%)、血浆BNP (pg/mL)水平和P53 的变化

由表1 可见，生理盐水组LVEF% (81. 08 ±1.86)高于阿霉素组是54.31 ±7.11(P ＜0.01);阿霉素组大鼠血浆BNP 水平为604.58 ±13.92 明显高于生理盐水组235.88 ±18.53(P ＜0.01);生理盐水组p53 表达量为2.74 ±0.36，明显低于阿霉素组34.70±2.10(P ＜0.01)，差异有统计学意义，见图2。

表1 造模前后各相关指标变化

图2 各组造模前后p53 电泳结果

3 讨论

细胞凋亡是一种高度保守、紧密调节的、受机体严格调控的程序性的细胞死亡方式，对维持细胞正常发育和细胞稳态至关重要。阿霉素诱导心肌细胞凋亡在其对心脏毒性损伤中起重要作用，阿霉素可以通过Faso Fas L 途径最终激活凋亡效应酶［6］、致心肌细胞线粒体功能障碍［7］、影响神经酰胺信号通路［8］及P53 等途径诱导心肌细胞凋亡，其中P53 途径是本实验研究的核心。研究表明P53 途径是细胞凋亡连锁反应中的首要因素，且P53 蛋白参与多种损伤所致的心肌细胞凋亡过程［9-10］。有研究认为P53 是通过细胞毒效应［11］、细胞内产生活性致氧(ROS)［12］、整合素介导的细胞间信号转位、诱导腺病毒EI A 蛋白表达［13］的途径来调控细胞凋亡，而Long 等［9］认为P53 基因是通过抑制心肌细胞和中性粒细胞中空泡质子A TP 酶的活性来介导细胞凋亡，另有研究者认为P53 基因也可通过上调c-myc基因、ICE 基因、促凋亡基因Bax，下调抑凋亡基因Bcl-2，升高细胞内Ca2 +来诱发细胞凋亡［11-13］。同时P53 基因编码的P53 蛋白是一DNA 结合蛋白，在细胞周期G1 期有调节作用。一般情况下，正常细胞中很少有P53 蛋白，当细胞受损出现DNA 损伤可提高P53 蛋白的浓度和活性，增多的P53 蛋白在细胞周期的G1 期发挥检查点功能，通过识别有损伤的DNA，阻止细胞进入下一周期，同时启动DNA 损伤修复机制。一旦修复失败，则启动细胞凋亡机制，最终导致细胞凋亡。Shizukuda［14］等的实验用阿霉素分别处理P53 基因敲除小鼠、野生型P53 基因小鼠，从而发现野生型P53 基因小鼠的心肌细胞凋亡数目明显高于P53 基因敲除小鼠。

本实验数据表明，反复经阿霉素处理的SD 大鼠心肌损伤明显，凋亡蛋白P53 的表达量显著增高，从而可得出阿霉素致心肌损伤过程中p53 的作用是显著的。在这个损伤过程中，阿霉素可能导致氧自由基的产生，从而促进心肌细胞内钙离子从肌浆网释放，进一步损害心肌细胞内钙清除系统，导致细胞内钙离子水平剧增。反之，细胞内钙水平的增加又可以通过活化钙敏感性活性氧生成激酶，诱导更多氧自由基的产生，从而使心肌细胞内P53 基因活化，存进P53 蛋白的产生，进而启动一系列凋亡程序，使心肌细胞出现凋亡;同样阿霉素也可能直接导致细胞DNA 的损伤，从而激活共济失调毛细血管扩张症突变激酶，使P53 累积增加，与此同时激活细胞外信号调节激酶1/2，可进一步诱导DNA 损伤，进而促进P53 磷酸化增加，上调P53 下游基因如Bax，激活内部凋亡途径，从而发挥强大的诱导细胞凋亡的功能促进心肌细胞凋亡。

综上所述，P53 在阿霉素致扩张型心肌病心肌损伤中有重要作用，其中涉及的其他机制还有待进一步明确。但我们有理由相信，随着基础研究的深入开展，阿霉素致心肌损伤机制会逐步明确，使阿霉素在临床用药更为安全有效。

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