透骨草提取物对人卵巢SKOV-3细胞Caspases蛋白表达的影响

2014-12-17 05:30田晶孙峥曾常茜
中医药信息 2014年1期
关键词:级联孵育卵巢癌

田晶,孙峥,曾常茜

(1.图们市石岘镇中心卫生院,吉林 图们 133101;2.大连医科大学,辽宁 大连 116044;3.大连大学医学院,辽宁省生物有机重点实验室,辽宁 大连 116622)

本课题组前期实验已证实,透骨草(Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara)提取物对人卵巢癌 SKOV-3细胞增殖具有明显的抑制作用[1-2],但其相关的分子机制尚不清楚。本实验采用吖啶橙染色法观察透骨草提取物对SKOV-3细胞形态的影响,并用免疫组化方法检测透骨草提取物对SKOV-3细胞凋亡相关分子 Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7蛋白表达的影响,旨在继续对透骨草提取物抑制SKOV-3细胞增殖的分子机制进行探讨,以期为卵巢癌的治疗寻找新的药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器

透骨草采自辽宁金州大黑山,经王心毓老先生鉴定为透骨草科植物 Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara,加热回流提取浓缩成干膏;鼠抗人Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7抗体(Cell Signaling Technology公司);SP免疫组化试剂盒、DAB显色液(福州迈新生物技术公司);RPMI 1640、小牛血清和胰蛋白酶(美国GIBCO公司);荧光显微镜(CX41,日本 Olympus公司)。

1.2 细胞系及培养

人卵巢SKOV-3细胞由吉林省肿瘤研究所提供;将SKOV-3细胞接种于含10%小牛血清、100 IU/ml青霉素和100mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中,37℃、5%CO2条件下培养至对数生长期,分组。实验组加入37.8μg/ml透骨草提取物(终浓度),对照组加入等体积RPMI 1640培养液,继续培养24h。

1.3 吖啶橙染色法观察SKOV-3细胞形态变化

收集实验组和对照组的SKOV-3细胞,用PBS缓冲液洗2次,1000r/min离心5min,用PBS缓冲液调整SKOV-3细胞浓度为1×1010个/L。取1×1010个/L细胞悬液95μl,加入0.1g/L 吖啶橙 5μl(终浓度 5μg/ml),置37℃孵箱中染色10min。取10μl SKOV-3细胞悬液滴于玻片上,封片,置荧光显微镜下观察,拍照。

1.4 免疫组化法检测 SKOV-3细胞 Caspase-9、Caspase-3和Caspase-7蛋白表达变化

免疫组化法采用SP法。分别收集实验组和对照组的SKOV-3细胞,涂片,丙酮固定;3%H2O2室温孵育15min,消除内源性过氧化物酶;正常山羊血清室温孵育 15min,封闭非特异性抗原;分别与鼠抗人Caspase-9、Caspase-3和 Caspase-7抗体37℃孵育2h,PBS洗3次;与生物素标记二抗室温孵育15min,PBS洗3次;与ABC液室温孵育10min,PBS洗3次。DAB染色,封片,显微镜下观察,细胞浆出现棕色判断为阳性细胞,无棕色者为阴性细胞,计数200个细胞并计算阳性细胞的比例。

1.5 统计学处理

Caspase-9、Caspase-3和 Caspase-7蛋白表达的阳性率用(±s)表示,组间比较采用t检验,P<0.05认为差异有显著意义。

2 结果

2.1 透骨草提取物对SKOV-3细胞形态的影响

未用透骨草提取物处理的对照组SKOV-3细胞形态比较规则,胞核较大且染色均匀。经37.8μg/ml透骨草提取物作用于SKOV-3细胞24h后,细胞形态不规则,细胞核固缩呈月牙形紧贴在核膜周围。

2.2 透骨草提取物对 SKOV-3细胞 Caspase-9、Caspase-3和Caspase-7蛋白表达的影响

未用透骨草提取物处理的对照组SKOV-3细胞Caspase-9蛋白高表达,细胞浆着棕黄色的细胞量多,经37.8μg/ml透骨草提取物处理后的SKOV-3细胞Caspase-9蛋白表达与对照组相比明显降低(P<0.05);未用透骨草提取物处理的对照组SKOV-3细胞Caspase-3蛋白高表达,细胞浆着棕黄色的细胞量多,经37.8μg/ml透骨草提取物处理后的SKOV-3细胞Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05);未用透骨草提取物处理的对照组SKOV-3细胞Caspase-7蛋白高表达,细胞浆着棕黄色的细胞量多,经37.8μg/ml透骨草提取物处理后的SKOV-3细胞Caspase-7蛋白表达明显降低(P<0.05),详见表1。

表1 免疫组化法检测SKOV-3细胞Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7蛋白表达结果(±s,n=3,%)

表1 免疫组化法检测SKOV-3细胞Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7蛋白表达结果(±s,n=3,%)

注:与对照组比较,△P <0.05。

Caspase-9 Caspase-3 Caspase-7对照组组别44.1 ±1.3 49.9 ±1.4 45.5 ±1.3实验组 11.1±1.4 12.6±1.0△ 13.1±0.7△

3 讨论

卵巢癌是妇科肿瘤中病死率最高的疾病,发病率呈不断上升趋势,寻找治疗卵巢癌的新药物是目前亟待解决的问题。本实验用吖啶橙染色法观察透骨草提取物对人卵巢癌SKOV-3细胞形态的影响,结果显示,37.8μg/ml透骨草提取物作用后的SKOV-3细胞形态不规则,细胞核固缩紧贴在核膜周围呈月牙形,说明透骨草提取物可诱导SKOV-3细胞凋亡。

Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节,Caspase-9为凋亡始动子,位于级联反应上游,能在其他蛋白参与下发生活化并激活下游的凋亡效应子Caspase-3、Caspase-7等,并通过切割特异性底物,引起细胞凋亡[3-4]。近期实验研究表明,药物诱导卵巢癌细胞凋亡与卵巢癌细胞Caspases级联反应密切相关[5-8]。透骨草提取物是否通过Caspases级联反应诱导SKOV-3细胞凋亡尚不清楚,本实验用免疫组化法检测透骨草提取物对SKOV-3细胞Caspases家族蛋白表达的影响。结果显示,37.8μg/ml透骨草提取物作用SKOV-3细胞24h后,Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7蛋白表达水平与对照组相比均显著下降,说明透骨草提取物可能通过激活 Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7蛋白酶的级联反应,引起SKOV-3细胞凋亡。

综上所述,透骨草提取物能诱导SKOV-3细胞凋亡,其机制与激活Caspases级联反应有关。卵巢癌细胞凋亡是一个多基因参与的复杂过程,透骨草提取物是否通过其凋亡相关蛋白诱导SKOV-3细胞凋亡,有待进一步深入研究。

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