二化螟幼虫病原真菌的分离纯化及其对烟粉虱和褐飞虱的毒力研究

王艳秋，洪 勇，岳霄霄，林华峰

(安徽农业大学植物保护学院合肥 230036)

烟粉虱Bemisia tabaci 是一种世界性害虫，可危害烟草、蔬菜等多种作物(张芝利等，2001;王茂明等，2006)，其平均每年在全球造成的经济损失高达数亿美元(Ittrich et al.，1994;王联德等，2003)。由于烟粉虱的严重发生，依赖广谱性农药的大量使用，导致烟粉虱产生了不同程度的抗药性，而且还存在杀伤天敌、污染环境等副作用(Horowitza et al.，1996;王秀芳等，2010)。褐飞虱Nilaparvata lugens 是我国水稻的主要害虫之一，它不仅直接危害水稻，还传播植物病毒病，给我国的水稻生产量造成严重损失(张松影等，2011;李茂业等，2012;林华峰等，2013)。目前，烟粉虱和褐飞虱的防治主要依靠化学防治，但由于化学农药的长期大面积不合理使用，导致烟粉虱和褐飞虱的抗药性呈不同程度的增强，再加上高效新型农药更新速度慢，使得烟粉虱和褐飞虱的发生和危害越来越猖獗严重(廖世纯等，2008;Teng et al.，2010;Pan et al.，2011;盛仙俏等，2013)。

随着环保意识的增强和对无公害农产品需求的不断提高，人们已经开展寻找开发新型生物农药资源(刘旭等，2007)，因此具有选择性高、不易使害虫产生抗药性、特异性强、简便安全、防治效果好及开发利用途径广等优点的生物农药引起了较多学者和科研人员的关注(贺伟华等，2007)。近些年来，以白僵菌、绿僵菌为代表的真菌杀虫药剂在害虫的持续控制及维护生物多样性方面所发挥的作用正越来越受到人们的关注。如白僵菌用于防治稻飞虱、烟粉虱等多种农业及经济作物害虫(陈德兰等，2013);绿僵菌对褐飞虱、瓢虫、菜青虫和蝗虫等害虫均有较为显著的防治效果(董辉等，2005;刘树峰等，2007;郭艳琼等，2007;Li et al.，2012);李茂业等(2011)从罹病褐飞虱虫体上分离出一株黄绿绿僵菌，对褐飞虱的致病率达83.8%。为此，本实验旨在从罹病二化螟幼虫体上分离真菌菌株，经分离鉴定，选择培养性状较好的供试菌株，对烟粉虱和褐飞虱两种重要农业害虫进行室内毒力测定，筛选出毒力较强的菌株，以期为杀虫真菌防治烟粉虱和褐飞虱提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株:从浙江省杭州市等地区采集自然感病致死的昆虫，挑取感染真菌致死的二化螟幼虫500 份，经安徽农业大学植物保护学院昆虫研究室分离纯化得到菌株Bb32、Bbr14、M23、Nr27 和A26，培养并保存。

烟粉虱虫源:采自安徽省和县温室蔬菜大棚，在安徽农业大学植物保护学院人工气候室室内用黄瓜连续饲养10 代以上。

褐飞虱虫源:采自安徽省庐江县农户未打药的水稻田，在安徽农业大学植保学院智能人工气候培养室内繁殖10 代以上。

PDA 培养基:土豆(去皮)200 g、葡萄糖20 g、琼脂20-25 g、蒸馏水1 L，pH 自然。

SDAY 培养基:葡萄糖4 g，琼脂2 g，蛋白胨1 g，酵母浸出粉1 g，蒸馏水100 mL，pH 自然。

1.2 试验方法

1.2.1 真菌生物学鉴定

筛选5种真菌分别接种于PDA 与SDAY 培养基上，于25℃恒温培养箱中培养。记录在培养基上培养15 d 后菌落颜色变化、直径大小、产孢初始时间、产孢量及孢子萌发率，并观察菌株分生孢子大小及形状、孢子梗的特点以及产孢细胞的着生方式和形态特征等。

1.2.2 生长速率与孢子萌发率测定

采用点植培养法接种。配制浓度为1.0×108孢子/mL 的孢悬液，点植于灭菌冷却的SDAY 培养基及PDA 培养基平板上，每皿1 点，重复3 次，置于(25±1)℃、RH＞85%、12L∶12D 光照培养箱中培养。从第3 天起，以十字交叉法测量菌落生长直径，取均值，比较各菌株在PDA 和SDAY 培养基上的生长速率，并测定不同培养基上菌株的孢子萌发率。

1.2.3 真菌对烟粉虱和褐飞虱的毒力测定

将5 株菌株接种在SDAY 培养基上，于(25±1)℃的恒温培养箱内培养10 d，将分生孢子粉刮到盛有20 mL 0.05%吐温-80 润湿剂的试管中，充分震荡混匀，血球计数板检测，均配制成浓度为1.0×108孢子/mL 的悬浮液。

采用叶片浸液法，对烟粉虱成虫及若虫进行室内毒力测定。挑取烟粉虱成虫及若虫，移入盛有处理叶片的烧杯中饲养，置于相对温度(26±1)℃、相对湿度60%-80%、光照周期14L∶10D的人工气候室中，分别处理60 头成虫及若虫，共计5个处理，重复3 次，并以含0.05%吐温-80 的纯净水作对照，每天观察并记录死亡数和僵虫数，连续观察10 d。

利用塔式喷雾法，进行褐飞虱成虫及若虫的室内毒力测定，培养皿用单层纱布封口，处理设置同烟粉虱，每个处理喷雾量为10 mL。

1.2.4 数据统计与分析

依据Abbott 公式计算校正死亡率。

实验数据使用DPS 统计分析软件(Tang and Zhang，2013)进行方差分析，并采用最小显著差异法(LSD)进行多重比较及生物统计模型进行分析。以时间(d)为X，累积校正死亡率的几率值为Y，采用几率值分析法，计算毒力回归方程和致死中时间(LT50)。

2 结果与分析

2.1 不同培养基上5种真菌菌落特征

比较所筛选的真菌菌株Bb32、Bbr14、M23、Nr27、A26 在两种培养基上的菌落颜色、形态特征及基质色泽等，初步鉴定结果显示5 株菌株分别为布氏白僵菌、球孢白僵菌、绿僵菌、莱氏野村菌和曲霉。由表1 看出，两株白僵菌在两种培养基上的菌落培养性状相差不大，而绿僵菌、莱氏野村菌、曲霉在两种培养基上的菌落培养性状相差甚多。

表1 供试菌株在不同培养基上的形态特征比较Table 1 Morphological characteristics tested strains on different media

2.2 不同培养基上5种真菌培养指标

2.2.1 直径及初始产孢时间

不同真菌在PDA 和SDAY 培养基的菌落生长直径和产孢时间如表2 和3 所示，相同菌株在SDAY 培养基上的生长速率快于PDA 培养基，而相同菌株在PDA 培养基上的初始产孢时间短于SDAY 培养基。曲霉A26 在3-11 d 中菌落直径与菌株Bb32、Bbr14、M23 和Nr27 差异明显，在第11 天时，其菌落直径为37.81 mm 和39.95 mm，明显高于其他真菌菌落，在两种培养基上初始产孢时间为2.83 d 和3.23 d，与其他菌株相比差异明显，低于菌株Bbr14 的3.33 d 和3.93 d。

表2 供试菌株在PDA 培养基上的培养性状Table 2 Comparison on incubation traits of the test strains on PDA media

表3 供试菌株在SDAY 培养基上的培养性状Table 3 Comparison on incubation traits of the test strains on SDAY media

2.2.2 产孢量及萌发率

菌株生长24 h 后，孢子萌发率越高，表明孢子萌发的速度较快。孢子萌发率的大小表明孢子生命力的强弱，这是菌株营养生长、培养性状是否良好的重要指标，也是菌株对寄主毒力大小的基本体现。由表4 可知，同一菌株在PDA 培养基上的产孢量大于SDAY 培养基上的产孢量，并且布氏白僵菌Bbr14 的产孢量最大，说明PDA 培养基适合菌株产孢。同一菌株在两种培养基上的萌发率相差不大，曲霉A26 的萌发率在5 株菌株中最高。除此之外，可以看出布氏白僵菌的产孢量明显大于其他菌株，说明在相同培养条件下，布氏白僵菌的产孢量明显有利于曲霉、莱氏野村菌、绿僵菌及球孢白僵菌。

2.3 供试菌株对两种害虫的室内毒力测定

2.3.1 对烟粉虱的毒力测定

在1×108孢子/mL 浓度下，5种菌株对烟粉虱成虫及若虫的室内毒力如表5 所示，5种菌株对烟粉虱成虫及若虫均有较强的致病力。曲霉A26 对烟粉虱成虫的校正死亡率在第3 天时为40.61%，明显高于其他菌株，但与菌株Bbr84 和Nr27 差异不明显(＜5%);在第9 天时死亡率达到最高为84.69%，僵虫率为91.17%，LT50最小为4.31 d;菌株Bbr84 其次，死亡率为85.86%，僵虫率为85.07%，LT50为5.19 d;莱氏野村菌Nr27 的校正死亡率为78.90%，僵虫率为84.86%，LT50为5.34 d，这3 株菌株的校正死亡率差异不明显，当僵虫率差异显著，而布氏白僵菌Bb32 和绿僵菌M23对烟粉虱成虫的致死率仅为70.36%和72.44%，僵虫率分别为74.22%和77.34%，LT50为6.77 d和5.78 d，相对其他3种真菌死亡率和僵虫率均较低。

表4 不同培养基上5种真菌菌株的产孢量测定Table 4 Fungal sporulation strains measurement on different media

表5 供试菌株对烟粉虱的致病力Table 5 Pathogenicity of test strains onB.tabaci

5种真菌对烟粉虱若虫也表现出了较强的毒力，在第9 天时，曲霉A26 和球孢白僵菌Bbr14 对幼虫的死亡率分别为77.62%和72.57%，差异不明显，僵虫率分别为88.24%和81.52%，差异明显，且均低于成虫的累计校正死亡率;而曲霉的LT50为4.87 d 相对于其他菌株为最小。

2.3.2 对褐飞虱的毒力测定

在喷雾量为10 mL 浓度为1×108孢子/mL 的条件下，供试菌株对褐飞虱成虫及若虫的室内毒力如表6 所示。5 株真菌菌株对褐飞虱成虫及若虫致病力的大小都有不同。由表6 可以看出，各处理在第10 天的校正死亡率为49.48%-87.54%，其结果明显高于空白对照组的自然死亡率(＜5%)。曲霉A26 对褐飞虱成虫的致死效果最佳为87.54%，感染率高达90.13%。致死中时仅有4.27d。球孢白僵菌Bbr14 和莱氏野村菌Nr27 对烟粉虱成虫的致死率分别为80.72%和80.35%，而绿僵菌M23 和布氏白僵菌Bb32 对烟粉虱成虫的致死率仅为74.18%和73.52%。曲霉A26 对褐飞虱若虫的致死效果最佳为73.18%，感染率高达87.13%，LT50为5.14 d。球孢白僵菌Bbr14 和莱氏野村菌Nr27 对烟粉虱成虫的致死率分别为67.39%和65.96%，而布氏白僵菌Bb32 和绿僵菌M23 对烟粉虱成虫的致死率仅为49.48% 和52.27%，并且同一菌株对褐飞虱的成虫致死效果优于若虫。

表6 供试菌株对褐飞虱的致病力Table 6 Pathogenicity of the test strains on Nilaparvata lugens(Stal)

3 结论与讨论

本试验通过对二化螟幼虫虫生真菌初步分离和鉴定，对所筛选的5种菌株的菌落颜色、质地、菌丝及菌株孢子、孢子梗、产孢结构等指标进行初步鉴定其所属种群，菌株A26 为曲霉，菌株Bbr14 为球孢白僵菌，菌株Bb32 为布氏白僵菌，菌株Nr27 为莱氏野村菌，菌株M23 为绿僵菌，这为下一步利用其防治农林害虫提供一定的理论基础和参考价值。

菌株形态学特征往往会因为其生长的营养条件及寄主的不同而不同。本文研究结果表明，真菌培养时，培养条件的不同导致菌落形态及长势不同，SDAY 培养基及PDA 培养基内所含营养物质不同，导致同一菌株的营养指标(菌落生长速度、初始产孢时间、产孢量)有所不同。同一株菌株在SDAY 培养基上的菌落生长速度均大于PDA 培养基上的生长速度，若培养菌体则SDAY培养基比较合适。各个菌株的产孢量在SDAY 平板培养基上显著小于PDA 平板培养基，若培养孢子，则PDA 培养基比较合适。林华峰等(2006)认为，在不同温度与培养基中，25℃温度条件下，PDA 培养基上，菌落的菌丝增长速度和产孢效果最好。严智燕等(2011)研究表明，SDAY 培养基碳源丰富，有利于菌丝的生长，从僵虫上分离得到的金龟子绿僵菌Ma10，在不同培养基上生长速度差别显著，这与本实验结论相符合。

本试验结果表明，5 株菌株对烟粉虱和褐飞虱成虫、若虫均表现出一定的毒力，不同菌株侵染致病效果不同，且不同菌株之间差异显著。其中曲霉A26 对烟粉虱成虫和若虫的致死效果最佳分别为84.69%和77.62%，感染率高达91.17%和88.24%。LT50仅有4.31 d 和4.87 d;其次是球孢白僵菌Bbr14 对烟粉虱成虫和若虫的致死效果，分别为78.76% 和72.57%，感染率为85.07% 和81.52%，LT50为5.19 d 和6.03 d，这两种真菌相对于菌株Nr27、M23 和Bb32 的效果明显较好。同样，曲霉A26 和球孢白僵菌Bbr14 对褐飞虱也表现出较强的致病力。毒力测定结果显示，在第10天时曲霉A26 和球孢白僵菌Bbr14 对褐飞虱成虫的校正死亡率为87.54% 和80.72%，感染率为90.13%和85.31%，LT50为4.27 d 和5.15 d;对于若虫的校正死亡率为73.18%和67.39%，感染率为87.13%和82.31%，LT50为5.14 d 和5.76 d，对成虫的致死效果优于若虫，均高于其他3种真菌。室内毒力测定结果分析发现，对两种重要害虫防治的试验中发现，菌株毒力与菌株萌发率、初始产孢时间具有一定的相关性。菌株萌发率越高、初始产孢时间越短，其毒性越强，该结论与刘玉军等(2008)在筛选高毒力菌株作用于栎旋木柄天牛Aphrodisium sauteri 的试验，以及蔡国贵等(2003)在防治刚竹毒蛾Pantana phyllostachysae的白僵菌优良菌株筛选试验等所得的结论相符合。这为曲霉和球孢白僵菌的进一步开发利用提供了应用空间和思路。但是由于目前曲霉有害毒素还未得到全面解释，所以在应用中还需审慎对待。参照已有研究资料和应用实践，白僵菌可作为防治农业害虫的真菌资源，进一步扩展其应用范围。

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