菜蛾盘绒茧蜂寄生对寄主小菜蛾幼虫丝腺的影响

黄 芳，郦卫弟，时 敏，吕要斌，陈学新*

(1.浙江省农业科学院植物保护和微生物研究所，杭州 310021;2.浙江大学昆虫科学研究所，杭州 310058)

小菜蛾Plutella xylostella 在进入蛹变态期前，会吐丝结茧，将蛹包裹在丝茧内得到保护。丝以氨基酸顺序高度重复的蛋白为主要成分，以液体形式存在于昆虫体内。在幼虫发育至近蛹期时，这些液体蛋白经由丝腺分泌排出体外。丝腺是一对管状的、具有合成和分泌丝线的腺体。有研究表明，鳞翅目昆虫用丝进行信息交流，控制周围的环境和自我保护(Schaller，1971)。菜蛾盘绒茧蜂是小菜蛾的优势寄生蜂，大量的研究表明其寄生对寄主的生理具有显著的影响，如功能血细胞死亡(Yu et al.，2007);脂肪体的结构被破坏，细胞功能缺失，营养物质无法大量积累(白素芬等，2009);精巢、中肠、前胸腺等器官结构发生异变，相关酶活性降低(狄蕊等，2006;Bai et al.，2009);此外，翅芽分化(白素芬等，2003)、精子发生(蔡东章等，2006)等生理过程也受到不同程度的破坏。但到目前为止，尚未有任何研究涉及该寄生蜂对寄主幼虫丝腺的影响。菜蛾盘绒茧蜂的前期个体发育在寄主体内完成，在进入蛹期之前，会在寄主体壁上钻孔爬出后化蛹;此时，寄主小菜蛾已丧失吐丝结茧的能力，寄主丝茧不成为幼蜂脱离寄主的阻碍。据此推测，菜蛾盘绒茧蜂通过抑制寄主丝茧的形成以便于完成自身个体发育。鉴于此，本文拟对菜蛾盘绒茧蜂寄生后小菜蛾丝腺相关的生理过程进行研究，以期进一步了解并补充该寄生蜂对寄主小菜蛾的生理调控机制。

1 材料与方法

1.1 昆虫饲养

小菜蛾的饲养条件为:22±1℃，60%-80%相对湿度，光周期L14∶D10;每天供给20%(体积比)的蜂蜜水。

菜蛾盘绒茧蜂饲养条件同上，每天供给10%的蜂蜜水。

1.2 供试昆虫的选取

小菜蛾2 龄幼虫大小及生理状态具有高度的一致性，因此为保证实验中处理与对照的可比性，供实验用虫均采用刚进入3 龄的幼虫。

寄生后小菜蛾幼虫的获取:采用单头寄生的方法，即在小试管(长8 cm、直径1.5 cm)内引入羽化2 d 已交配过的雌蜂1 头，然后用毛笔挑取小菜蛾幼虫1 头放入管内，观察产卵行为发生1 次后用毛笔移出幼虫，换另1 头未寄生的幼虫重复操作，控制每头雌蜂寄生30 头左右。将寄生过的小菜蛾幼虫接到事先准备好的叶片或盆菜上饲养，用于实验。

1.3 丝腺的解剖及获得

菜蛾盘绒茧蜂寄生后的小菜蛾，在寄生后，每隔24 h 取样，直至茧蜂幼虫从寄主小菜蛾体内钻出为止。

在PBS 中解剖虫体，将完整的丝腺取出后在相同的缓冲液中清洗三次，然后将丝腺挑入冰浴中的PBS 中，研磨后，800 g 离心10 min，上清为丝腺内分泌物样品，于-80℃储存。

1.4 丝腺蛋白分析

以SDS-PAGE 电泳的方法分析丝腺蛋白组分，电泳条件为:12%的分离胶，2.5%浓缩胶，电极缓冲液为Tris-甘氨酸电极缓冲液系统;电泳电压80 V。Bradford 方法测蛋白浓度。

2 结果与分析

2.1 寄生对寄主小菜蛾丝腺形态的影响

正常小菜蛾幼虫丝腺形态的变化过程:2 龄小菜蛾幼虫丝腺细胞已清晰可见，顶端两列分泌类细胞交替有序排列，圆形胞核位于细胞中央，可以观察到浓缩后呈条带相互缠绕的DNA(图1A);发育至3 龄后，细胞纵向成长为原来的2 倍，胞核亦随之扩大，呈椭圆位于细胞中央，核内物质均匀，但电子紧密度低于2 龄幼虫(图1B);发育至4 龄初，胞质密度加大，胞核被挤至细胞边缘(图1C)，至4 龄末，胞内无明显核质分界，两列细胞间出现直径匀一的管道空腔，可以看到均匀膨大的管道内充满透明的液体(图1D);至预蛹时，细胞结构模糊，空腔亦消失(图1E)，此后12 h，细胞结构完全消失(图1F)。

图1 未寄生小菜蛾不同龄期丝腺顶端分泌细胞结构观察Fig.1 Structure of anterior cells in the silk gland of Plutella xylostella larvae

被菜蛾盘绒茧蜂寄生后2 龄小菜蛾发育至3 龄时，其丝腺细胞胞核肿胀，占据细胞大部分空间，细胞形状不匀一，有时两列细胞间可出现畸形的空腔(图2A);发育至4 龄初，胞内结构消失，但胞间分隔仍清晰可见(图2B)，至4 龄末，细胞结构消失(图2C)。

图2 菜蛾盘绒茧蜂寄生后小菜蛾不同龄期丝腺顶端分泌细胞结构观察Fig.2 Structure of anterior cells in the silk gland of Plutella xylostella larvae parasitized by Cotesia vestalis

2.2 寄生对寄主小菜蛾丝腺长度及蛋白浓度的影响

小菜蛾被菜蛾盘绒茧蜂寄生后，其丝腺长度及蛋白浓度变化如图3 所示。寄生后小菜蛾幼虫的丝腺长度显著短于对照;同时丝腺内蛋白含量也显著低于对照。

2.3 寄生对寄主小菜蛾丝腺蛋白组分的影响

菜蛾盘绒茧蜂寄生后对寄主小菜蛾幼虫丝腺分泌蛋白组成的影响如图4 所示:寄生后0-12 h之内，不管是丝腺分泌腔内还是丝腺分泌细胞的蛋白组分都没有发生变化;在寄生后24 h 时，对照丝腺分泌细胞内出现一个分子量大小约为80 kDa的蛋白，随着时间发展，这个蛋白的分泌量越来越大，而寄生后则没有;在寄生后12 h 和24 h，对照和寄生后的幼虫均存在大小为180 kDa 左右的蛋白，但是经过36 h 后对照样品内此蛋白消失，而在寄生后的幼虫中则一直存在;同时对照内出现了分子量在80-90 之间、30-60 之间的大量蛋白，但是寄生后则没有，除了一个分子量为20 kDa 的蛋白。总的来说，被茧蜂寄生后的寄主小菜蛾幼虫丝腺的分泌蛋白与对照的主要区别在于50 kDa以上的蛋白含量和种类的不同。

图3 菜蛾盘绒茧蜂寄生对小菜蛾丝腺长度及蛋白含量的影响Fig.3 Effects of parasitism by Cotesia vestalis on the length and protein concentration in the silk gland of the diamondback moth

图4 菜蛾盘绒茧蜂寄生对小菜蛾幼虫丝腺蛋白组分的影响Fig.4 Effects of parasitism by Cotesia vestalis on the protein profiles in the silk gland of the diamondback moth

3 结论与讨论

小菜蛾幼虫丝腺属于下唇型原生丝腺，与家蚕的丝腺功能相同，主要用于泌丝(Marsh et al.，1955;王孟卿和彩万志，2004);但另有研究证实，丝腺细胞的分泌物质还与虫体的其他生理过程密切相关，如免疫系统(Kim et al.，2010a)、钙离子内平衡(Kim et al.，2010b)等。家蚕幼虫期丝腺体积的增加全靠细胞的膨大，当幼虫完成吐丝结茧进入预蛹期开始变态时丝腺细胞被消化，化蛹后腺细胞全部消失(Terashima et al.，2000)。小菜蛾丝腺的发育过程与家蚕类似，其消亡过程为一系列的细胞凋亡过程(钟仰进等，2005)。被菜蛾盘绒茧蜂寄生的小菜蛾体内的大部分营养物质被寄生蜂吸收(白素芬等，2009)，同时，寄主幼虫体内的激素水平会发生一系列的变化(Lee and Kim，2004)，以上代谢过程的改变都可能是导致丝腺细胞无法膨大的原因;同时，丝腺细胞分泌功能的衰减或丧失可能导致小菜蛾幼虫的免疫系统进一步变弱，以利于寄生蜂幼蜂的生长发育。张义成等通过比较18种鳞翅目昆虫丝腺的形态及内部结构，认为丝腺细胞的膨大及数量直接与丝腺细胞对血淋巴中的氨基酸利用率的高低相关;因此，小菜蛾被菜蛾盘绒茧蜂寄生后丝腺的形态变化可能源于寄主体内免疫系统紊乱，营养物质缺失，寄主体内的能量重新分配和激素水平改变，但以上推测仍需进一步的研究进行证实。

被菜蛾盘绒茧蜂寄生后的寄主小菜蛾幼虫丝腺的分泌蛋白与对照的主要区别在于寄生后幼虫丝腺内容物缺失了几种大小在50 kDa 以上的蛋白，而该类大分子蛋白是鳞翅目幼虫丝茧形成的主要蛋白;此类蛋白的缺失可能是由于丝腺前端分泌类细胞结构受损造成的。

References)

Bai SF，Chen XX，Cheng JA，et al.Effects of parasitism factors of the parasitoid Cotesia plutellae on fat body structure of the host Plutella xylostella larvae［J］.Acta Entomological Sinica，2009，48(2):166-171.［白素芬，陈学新，程家安，等.菜蛾盘绒茧蜂茧蜂主要寄生因子导致的寄主小菜蛾幼虫脂肪体结构的变化［J］.昆虫学报，2009，48(2):166-171］

Bai SF，Chen XX，Cheng JA，et al.Characterization of Cotesia plutellae polydnavirus and its physiological effects on the diamondback moth，Plutella xylostella larvae［J］.Acta Entomological Sinica，2003，6(4):401-408.［白素芬，陈学新，程家安，等.菜蛾盘绒茧蜂多分DNA 病毒的特性及其对小菜蛾幼虫的生理效应［J］.昆虫学报，2003，6(4):401-408］

Bai SF，Cai DZ，Li X，et al.Parasitic castration of Plutella xylostella larvae induced by polydnaviruses and venom of Cotesia vestalis and Diadegma semiclausum［J］.Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2009，70(1):30-43

Cai DZ，Bai SF，Li X，et al.Effects of parasitization by three endoparasitoids on spermatogenesis in their hosts，Plutella xylostella larvae［J］.Acta Entomological Sinica，2006，49(6):908-917.［蔡东章，白素芬，李欣，等.三种内寄生蜂寄生对小菜蛾幼虫精子发生的影响［J］.昆虫学报，2006，49(6):908-917］

Di R，Chen YF，Bai SF，et al.Effects of Cotesia plutellae polydnaviruses on partial tissues of host Plutella xylostella larva［J］.Chinese Journal of Biological Control，2006，22(4):268-274.［狄蕊，陈亚锋，白素芬，等.菜蛾盘绒茧蜂多分DNA 病毒对寄主小菜蛾幼虫体内部分组织的影响［J］.中国生物防治，2006，22(4):268-274］

Kim RJ，Jo YH，Oh SE，et al.Cloning and expression pattern of a hemolin homologue from the diamondback moth，Plutella xylostella［J］.Genes ＆ Genomics，2010a，32:71-77.

Kim RJ，Oh SE，Noh MY，et al.Molecular cloning and expression profiles of calreticulin gene from the diamondback moth，Plutella xylostella［J］.Entomological Research，2010b，40:217-224.

Lee S，Kim Y.Juvenile hormone esterase of diamondback moth，Plutella xylostella，and parasitism of Cotesia plutellae［J］.Journal of Asia-Pacific Entomology，2004，7:283-287.

Marsh RE，Corey RB，Pauling L.An investigation of the structure of silk fibroin［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1955，16:1-34

Schaller F.Indirect sperm transfer by soil arthropods［J］.Annual Review of Entomology，1971，16:407-446.

Terashima J，Yasuhara N，Iwami M，et al.Programmed cell death triggered by insect steroid hormone，20-hydroxyecdysone，in the anterior silk gland of the silkworm，Bombyx mori［J］.Development Genes and Evolution，2000，210:545-558.

Wang MQ，Cai WZ.Silk and silk glands of insects［J］.Entomological Knowledge，2004，41(1):90-95.［王孟卿，彩万志.昆虫的丝和丝腺［J］.昆虫知识，2004，41(1):90-95］

Yu RX，Chen YF，Chen XX，et al.Effects of venom/calyx fluid from the endoparasitic wasp Cotesia plutellae on the hemocytes of its host Plutella xylostella in vitro［J］.Journal of Insect Physiology，2007，53(1):22-29.

Zhong YJ，Zeng L，Huang ZJ，et al.Characteristicsof degeneration and apoptosis of silk gland during the larval-pupal metamorphosis in the silkworm，Bombyx mori［J］.Acta Entomological Sinica，2005，48(3):319-324.［钟仰进，曾林，黄志君，等.家蚕蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征.昆虫学报，2005，48(3):319-324］