响应面法优化山杏仁脱苦工艺的研究

张乔会，李 军，逄锦慧，崔 洁，王建中，*

(1.北京林业大学生物科学与技术学院，林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083;2.北京林业大学材料科学与技术学院，林木生物质化学北京市重点实验室，北京100083)

苦杏仁为蔷薇科杏属Armeniaca植物带苦味种子或种仁的统称，广义而言包括西伯利亚杏 A.sibirica、毛杏 A.sibirica var.pubescens、杏 A.vulgalis、野杏A.vulgalis var.ansu、东北杏A.mandshurica及光叶东北杏A.mandshurica var.glabra等。我国的苦杏仁产量全世界首屈一指，在国际坚果市场中占有重要的地位［1］。苦杏仁营养价值丰富，含有多种营养成分如蛋白、油脂、无机元素等［2-7］。

苦杏仁中的苦味主要来自它所含的苦杏仁苷，脱苦是苦杏仁加工生产中必须的工艺流程［8-9］，苦杏仁传统脱苦常用冷水拔苦法、去皮冷水拔苦法［10］、酸处理法［11-12］、碱处理法［10］、清水热烫法等方法。传统脱苦方法具有能耗水耗大，或脱苦时间长，或环境污染重等缺陷。减压辅助脱苦对苦杏仁脱苦来说是一个全新的方法，和传统工艺操作方法上具有显著的不同，但都是将苦味物质苦杏仁苷分解以去除苦味［13］。利用该方法可以大幅度地加速苦杏仁苷的分解，同时可以回收得到苦杏仁香精。我国苦杏仁资源量极大，年产杏核20余万t［1］，研究苦杏仁脱苦，对苦杏仁深加工，如制作杏仁露、杏仁粉等具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦杏仁 购自河北承德地区的山杏仁，经鉴定为西伯利亚杏Armeniaca sibirica的种子，娃哈哈纯净水，色谱纯甲醇，色谱纯苦杏仁苷标准品。

SHZ-88A水浴锅 太仓市实验设备厂;RE-5203旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;METTLER TOLEDO电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;岛津DGU-20A3高效液相色谱 日本岛津公司;台式离心机 上海安亭科学仪器厂;冷冻干燥机FD-1 北京德天佑科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 减压脱苦工艺流程 将苦杏仁置于约2倍重量的沸水中漂烫1～2min，捞出后去除种皮，然后按料液比1∶8-1∶16(W/V)的比例加入纯净水，置于胶体磨中打浆7min;取180mL的浆液置于1000mL的带水浴的旋蒸瓶中，设置水浴锅温度和真空度，开始真空减压旋蒸脱苦。

1.2.2 脱苦所得浆液感官评价 对旋蒸所得浆液进行感官评价，每隔一段时间品尝一次，直至无苦味，以此找出不同温度、不同真空度、不同料液比下的最短旋蒸时间。各处理随即编号后由十名经过良好培训的感官评判人员来评定打分，然后计算平均值。口感苦味等级分为极苦:分值为0～25(D级)、苦:分值为25～50(C 级)、微苦:分值为50～75(B 级)、无苦味:分值为75～100(A级)四个级别。

1.2.2.1 样品苦杏仁苷含量的测定 利用高效液相色谱对未脱苦的浆液和脱苦评分后所得A、B、C、D级样品分别测定其中苦杏仁苷的含量，操作流程为:取适量真空浓缩处理后和未处理的打浆液置于培养皿中，经真空冷冻干燥得干粉，脱脂。精确称取脱脂干粉10g，150mL乙醇回流30min，离心，取上清液减压抽滤，挥发至干，甲醇溶解定容至50mL容量瓶中。取2mL定容溶液过0.2μL微孔滤膜入式样瓶，通过高效液相色谱手动进样检测。

1.2.2.2 高效液相色谱标准曲线 精密称取苦杏仁苷标准品100mg，甲醇溶解，50mL容量瓶定容，浓度为 2.0mg/mL。依次稀释得到 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mg/mL 的标准溶液，微孔滤膜过滤。用高效液相色谱检测，得到样品含量和峰面积之间的标准曲线，浓度与峰面积成线性关系。色谱条件为，C18柱(4.6mm ×150mm);流动相:甲醇∶水(20∶80);检测波长 210nm;流速:1mL/min;柱温:室温;进样量:10μL。

1.2.2.3 样品中苦杏仁含量的计算 样品中苦杏仁苷的含量=50x0/10000×100%，x0为液相色谱检测所得的样品对应的苦杏仁苷的浓度。

1.2.3 脱苦预实验 由于苦杏仁减压法脱苦鲜见报道，而据生产实际，温度是影响脱苦效果极为重要的因素，所以在较大的温度范围内，即从30℃到90℃每隔15℃为一梯度差做了脱苦预实验，并设定常压、-0.05MPa、-0.09MPa作对照进行预实验。其他条件设定为料液比1∶10，真空度为-0.09MPa，脱苦时间为无苦味时所需的时间，30、45、60、75℃脱苦时平均每10min检测一次苦味的变化;90℃下2min检测一次。

1.2.4 单因素实验设计 选择脱苦时间、液料比、添加柠檬酸的浓度、真空度为单因素变量，分别确定各因素的最佳水平，为响应面设计确定因素水平提供支持。

从字形特征与书写风格来看，郭店楚简的内容不是单一的，而是杂糅了不同地域特征的文献。周凤五先生曾从字体的角度将郭店楚简的内容分为四类，明确指出第四类与齐国文字的特征最为吻合[7]。经过比较可以发现，郭店简中《语丛一》、《语丛二》、《语丛三》以及《唐虞之道》、《忠信之道》较多地保留了齐鲁文字的特征。

1.2.4.1 脱苦时间 设置减压脱苦的温度为80℃，柠檬酸浓度为0.2g/L，真空度为-0.09MPa，取200mL打浆苦杏仁液，置于1000mL旋蒸瓶中，选择脱苦时间为 25、20、15、10、5min，真空浓缩所得脱苦杏仁浆液由评判人员感官评价，确定级别和分值。

1.2.4.2 液料比 设置真空浓缩的温度为80℃，真空度为-0.09MPa，脱苦时间为15min，柠檬酸浓度为0.2g/L，取200mL与水以不同的液料比打浆苦杏仁液置于 1000mL旋蒸瓶中，选择液料比 6、8、10、12、14(mL/g)进行真空浓缩，所得脱苦杏仁浆液由评判人员感官评价，确定级别和分值。

1.2.4.3 柠檬酸浓度 设置真空浓缩的真空度为-0.09MPa，脱苦时间为15min，取200mL打浆苦杏仁液，置于1000mL旋蒸瓶中，选择添加的柠檬酸浓度分别为0.05、0.08、0.1、0.2、0.3g/L 进行真空浓缩，所得脱苦杏仁浆液由评判人员感官评价，确定级别和分值。

1.2.4.4 脱苦温度 设置真空浓缩的真空度为-0.09MPa，脱苦时间为15min，柠檬酸浓度为0.2g/L，取200mL与水以液料比10(mL/g)的比例打浆苦杏仁液，置于1000mL旋蒸瓶中，选择脱苦温度为70、75、80、85、90℃进行真空浓缩，所得脱苦杏仁浆液由评判人员感官评价，确定级别和分值。

1.2.5 响应面实验设计 选择浓缩时间、液料比、柠檬酸浓度和真空度为四个因素，根据Box-Behnken中心组合设计实验原理，设计四因素三水平响应面实验［14-18］，根据单因素实验结果设计水平值。

表1 响应面分析因素水平表Table1 Analytical factors and levels for RSA

1.2.6 数据处理 实验数据均采用Microsoft excel 2007软件及Box-Behnken软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 样品苦杏仁苷含量的测定

结果表明，苦杏仁苷标准品在0.02～0.1mg/mL范围内，对应的峰面积与苦杏仁苷浓度成线性关系，得到的回归方程为:

y=1E+0.7x-319893 R2=0.9995

式中:y-苦杏仁苷标准品在高相液相色谱中的峰面积;x-苦杏仁苷标准品的浓度，mg/mL。

图1 苦杏仁苷标准曲线Fig.1 Standard curve of Laetrile

经检测，苦杏仁中苦杏仁苷的含量为4.45%;评分D级的样品中苦杏仁苷的含量为4.45%～3.16%;评分C级的样品中苦杏仁苷的含量为3.16%～1.57%;评分B级的样品中苦杏仁苷的含量为1.57%～0.43%;评分A级的样品中苦杏仁苷的含量为0.43%～0。经过对评分后的样品进行液相检测可知，对脱苦产品的苦味评分符合实际，具有可操作性，可以作为评判依据。

图2 苦杏仁苷标准品液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of standard Laetrile sample

图3 样品液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram of sample

2.2 减压脱苦预实验结果

初步减压脱苦实验表明，与常压脱苦相比，减压脱苦明显缩短脱苦时间;在真空度维持在-0.09MPa的情况下，随着温度的上升，脱苦时间明显缩短。

表2 减压脱苦预实验结果Table 2 Result of preliminary test for reduced pressure debittering

2.3 单因素实验

2.3.1 确定最佳的脱苦时间 图4表明，脱苦效果随着时间的增加而提高，当时间为15min时评分为85.8，已经达到无苦(A等级)的要求了，且变化趋于平缓，20min评分86.3和25min评分86.9和15min时相差不大，推测可能是因为苦杏仁中的苦杏仁苷基本分解完毕。根据节约能耗和缩短时间的要求，选择15min为最佳的脱苦时间。

2.3.2 确定最佳的液料比 图5表明，在液料比6至10时，脱苦效果随着液料比的增加而提高，随后开始下降，当液料比为16时脱苦评分88，与液料比为10时脱苦评分87.3，相差不大。液料比为6时评分为74分，基本无苦了，说明液料比对脱苦效果影响不大。且液料比为10时已经满足需求了，所以选择液料比10为最佳的液料比。

图4 时间对脱苦效果的影响Fig.4 Effect of time on removal of bitterness

图5 液料比对脱苦效果的影响Fig.5 Effect of ratio liquid to material on removal of bitterness

2.3.3 确定最佳的柠檬酸浓度 图6表明，在0.05～0.2g/L之间，随着柠檬酸的浓度增大，脱苦效果逐步提高，当柠檬酸浓度为0.2g/L时已经达到无苦味的效果，且趋于平缓，0.3g/L和0.2g/L差别很小。推测可能是因为当柠檬酸在0.2g/L时，已经能够满足酸催化苦杏仁苷分解的反应要求，所以选择0.2g/L作为最佳的柠檬酸浓度。

图6 柠檬酸浓度对脱苦效果的影响Fig.6 Effect of citric acid concentration on removal of bitterness

2.3.4 确定最佳的脱苦温度 图7表明，在70～85℃时，随着温度的增高脱苦效果逐步提高，在80℃后脱苦效果趋于平缓，提高不大。70～75℃时脱苦评分从55.7提高到63.3，75～80℃时脱苦评分从63.3提高到84，80～85℃时，脱苦评分由84 分提高到85.5，90℃时为85.2，80℃已能满足要求。为节约能源，选择80℃为最佳的脱苦温度。

图7 温度对脱苦效果的影响Fig.7 Effect of temperature on removal of bitterness

2.4 响应面分析结果讨论

2.4.1 实验结果 以脱苦时间(X1)、液料比(X2)、柠檬酸浓度(X3)和脱苦温度(X4)为自变量，脱苦后评分(Y)为响应值，进行响应面实验，实验结果见表3。

表3 实验设计方案和实验结果表Table 3 Program and experimental results of RSA

利用Design-Expert7.1.6软件进行响应面回归分析，得到拟合回归方程为:

Y=87.12+10.44X1-0.41X2+4.38X3+9.96X4+0.13X1X2+0.075X1X3-4.07X1X4+0.075X2X3+0.87X2X4+0.57X3X4-5.06X12-2.51X22+5.46X32-8.31X42。决定系数R2=0.9204，说明该回归模拟实验的拟合情况良好，实验值和预测值比较接近，通过方差分析及相关的系数考察模型的可靠性。

2.4.2 方差分析 由方差分析可知，模型在p≤0.01时水平差异显著，因变量与自变量之间的线性关系显著(R2=0.9204)，较好地描述实验结果。从表4可以看出，X1、X3、X4、X42为极显著影响因素，X12、X32、X1X4项为显著影响因素。通过对Y的回归系数的检验可知，各因素对脱苦效果影响的大小顺序为:脱苦时间(X1)＞脱苦温度(X4)＞柠檬酸浓度(X3)＞料液比(X2)。

2.4.3 响应面分析 根据拟合函数，每两个因素对应的评分值画出响应面和等高线图，考虑到定性分析各因素对评分的关系，固定另两个因素时，均做“0”水平处理。

图 8 Y=f(X1，X2)的响应面Fig.8 Responsive surfaces graph of Y=f(X1，X2)

图 9 Y=f(X1，X3)的响应面Fig.9 Responsive surfaces graph of Y=f(X1，X3)

图8～图13比较直观的反映了每两个因素对响应值的影响。其中温度和时间这两个因素对响应值的影响大，实际生产中要考虑节能和省时间，在保证无苦味的基础上，要降低这两个值。经过软件优化得到的工艺为，脱苦时间20min，液料比为10∶1，柠檬酸浓度为 0.24g/L，脱苦温度为 82℃，真空度为-0.09MPa，优化预测值为94.6。经实验检验，此时得到的脱苦浆液实际评分为95，完全无苦味，与理论预测值接近，证明该回归模型具有可靠性。

3 结论

建立了真空浓缩新工艺，突破了传统工艺先脱苦后打浆的思路，探索了先打浆后脱苦，优化工艺为脱a:*为5%显著水平，b:＊＊为1%显著水平苦时间20min，液料比为10，柠檬酸浓度为0.24g/L，脱苦温度为82℃，真空度为-0.09MPa，与传统工艺(80℃热水一般浸泡3～4h)相比，时间缩短了9～12倍，大幅节省了时间。对于样品中的氰化物，可以通过浓缩后继续加水来降低浓度，对于馏出液和真空泵中的水要进行脱毒处理，可以用碱液吸收。工厂的实际生产中，要特别重视真空浓缩设备的设计，严防氰化物挥发造成人员中毒。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

图 10 Y=f(X1，X4)的响应面Fig.10 Responsive surfaces graph of Y=f(X1，X4)

图 11 Y=f(X2，X3)的响应面Fig.11 Responsive surfaces graph of Y=f(X2，X3)

图 12 Y=f(X2，X4)的响应面Fig.12 Responsive surfaces graph of Y=f(X2，X4)

图 13 Y=f(X3，X4)的响应面Fig.13 Responsive surfaces graph of Y=f(X3，X4)

［1］王利兵，王涛.新型木本能源植物山杏的调查与研究［C］.非粮生物质能源与高技术产业化研讨会论文集，福州:2010，11:33-36.

［2］D H Dwivedi，R B Ram.Chemical composition of bitter apticot kernelsfrom Ladakh，India［J］.InternationalSociety for Horticultural Science，2006，12:53-58.

［3］许宁侠，陈邦，申烨华.响应面法优化长柄扁桃中苦杏仁苷的提取工艺［J］.食品工业科技，2014，35(4):270-273.

［4］Mukta N，Murthy IYLN，Sripal P.Variability assessment in Ponganria pinnata(L.)Pierre germplasm for biodiesel traits［J］.Ind Crops Prod，2009，29:536-540.

［5］宋日钦，王建中，王少伟.山杏挥发油提取工艺的研究［J］.食品工业科技，2006，27(10):123-125.

［6］杨晓宇，陈锦屏.杏仁的营养保健功能及其在食品加工中的应用［J］.食品科学，2005，26(9):629-631.

［7］航晓敏，唐涌濂，柳向龙.多步饱和脂肪酸的研究进展［J］.中国临床营养杂志，2000，8(4):251-254.

［8］李科友，史清华，朱海兰，等.苦杏仁化学成分的研究［J］.西北林学院学报，2004，19(2):124-126.

［9］Abdelmadjid Silem，Hans-Otto Günter ，Jörn Einfeldt，et al.The occurrence of mass transport processes during the leaching of amygdalin from bitter apricot kernels:detoxification and flavour improvement［J］.InternationalJournalofFood Science ＆Technology，2006，41(2):210-213.

［10］朱丽清.苦杏仁系列蛋白食品加工工艺［J］.河北果树，2012(2):30-33.

［11］于淼，张华，鲁明.杏仁脱皮去苦及杏仁油脱色研究［J］.食品科技，2007(2):108-110.

［12］臧瑾康，吴纯红，沈中，等.苦杏仁脱苦去毒的最佳工艺条件探讨［J］.四川食品与发酵，1997(4):22-26.

［13］张宁，程新华.苦杏仁真空脱苦新方法及设备［P］.中国专利:92105361.4，1992-04-08.

［14］吴发旺，刘春雷.响应面优化冷榨法制取山桐子油工艺的研究［J］.食品工业科技，2012，33(11):278-282.

［15］吴萍萍，赖曼萍，尹艳艳，等.响应面法优化山稔叶总黄酮提取工艺的研究［J］.食品工业科技，2014，35(4):223-232.［16］周芳，赵鑫，宫婕，等.响应面法优化超声辅助提取红皮云杉多酚工艺［J］.食品工业科技，2014，35(1):210-218.

［17］Yaw-Nan Chang，Jen-Chang Huanga，Chih-Chen Leeb，et al.Use of response surface methodology to optimize culture medium for production of lovastatin by Monascus ruber［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，30(7):889-894.

［18］WC Leea，SYusofa，NSA Hamidb，et al.Optimizing conditions for enzymatic clarification of banana juice using response surface methodology(RSM)［J］.Journal of Food Engineering，2006，73(1):55-63.