酵母源金属硫蛋白体外清除自由基及抑菌活性的研究

徐炳政，王 颖，2，张东杰，* ，易伟民

(1．黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319;2．国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江大庆163319)

金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)是一种低分子量、富含半胱氨酸的胞内蛋白质［1］。传统研究证实MT几乎存在于所有哺乳动物中，而且在部分组织中大量富集，随着对MT研究的深入及基因工程等技术的引入，越来越多的MT及类似物被发现于高等植物、原核及真核微生物中。金属硫蛋白结构复杂，含多种异构体形式，结构中含有丰富的巯基［2］，该结构赋予了金属硫蛋白多种生物学功能。已有大量资料证明金属硫蛋白具有显著的抗氧化、抗肿瘤［3］、重金属解毒［4］、调节机体免疫力及微量元素平衡等功能。

自由基是机体氧化反应产生的有害产物，对细胞膜、线粒体、遗传物质(DNA)、脂肪和碳水化合物等具有强损害作用［5］，目前认为自由基为机体衰老及多种疾病发生的根源。传统研究使用的金属硫蛋白主要提取于动物肝脏，但存在周期时间长、提取量低和价格昂贵等弊端，而从微生物中诱导提取金属硫蛋白因其周期短、易操作与价格低廉等特点逐渐引起了各国学者的重视。本文以兔肝Zn-MT为对照，探讨了两种异构形式的酵母源金属硫蛋白体外清除自由基及抑菌功能活性，为金属硫蛋白的活性研究及深入开发利用提供一定的实验基础及数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兔肝Zn-MT(纯度99%) 购自大连保税区联合博泰生物技术有限公司;酵母源金属硫蛋白(MT-Ⅰ、MT-Ⅱ，纯度95%) 黑龙江八一农垦大学食品学院实验室自提;结晶紫(Cv)、硫酸亚铁(FeSO4)、过氧化氢(H2O2)、邻苯三酚 国药集团化学试剂有限公司。

DPPH sigma公司;ultrospec 3300 pro紫外分光光度计 英国Biochrom公司;BP301S电子天平 德国Sartorius公司。

1.2 实验方法

1．2．1 酵母源金属硫蛋白对羟自由基清除率 与H2O2与Fe2+能够混合产生羟基自由基，而过氧化氢自由基能够与结晶紫发生亲电加成反应，从而使结晶紫褪色［6］，因此采用H2O2-Fe2+体系体外模拟产生羟基自由基，以结晶紫为显色剂，探讨酵母源金属硫蛋白对羟自由基清除率。并稍加改进，实验前使用蒸馏水将结晶紫配制为0．7×10-3mol/L溶液，硫酸亚铁配制为0．7×10-3mol/L溶液，过氧化氢采用蒸馏水配制为0．05%(质量分数)溶液。取1．2mL结晶紫溶液和0．2mL FeSO4溶液于比色皿中，510nm处测定吸光值 A0，分别加入0．16mL H2O2溶液，510nm 处测定吸光值A1，向上述溶液体系中分别加入不同浓度MT样品及Vc溶液，加入同体积蒸馏水为空白组，用Tris-HCl缓冲液稀释至20mL，测定吸光值，室温避光静置5min，测定吸光值A2，羟自由基的清除率(S)参照以下公式计算:

1．2．2 酵母源金属硫蛋白对超氧阴离子自由基清除率 参照文献方法，采用邻苯三酚体系测定MT对超氧阴离子自由基清除率［7］。实验前将邻苯三酚配置为5×10-3mol/L溶液，取0．15mL邻苯三酚溶液于25mL比色皿中，加25℃的Tris-HCl缓冲液定容至20mL，调节 pH7．7，322nm 处迅速测定体系吸光值A3，向上述溶液体系中分别加入不同浓度MT样品及VC溶液，另设同体积蒸馏水为空白组，30℃静置温浴1h，322nm处迅速测定溶液吸光值A4。超氧阴离子自由基清除率(S)按以下公式计算。

1．2．3 酵母源金属硫蛋白对DPPH自由基清除率 DPPH自由基是一种极为稳定的有机自由基，DPPH自由基溶于甲醇后显紫红色，当加入自由基清除剂后，DPPH的孤对电子被配对，从而褪色，因此DPPH被广泛用于自由基清除及抗氧化研究。参照文献方法［8］，实验前将 DPPH 配制为 59．85μmol/L 工作液，分别取3．9mL DPPH工作液与0．1mL甲醇混合加入25mL比色皿中，517nm处测定吸光值A5，向上述溶液体系中分别加入不同浓度MT样品及VC溶液，另设同体积蒸馏水为空白组，室温避光静置5min，测定吸光值A6，按以下公式计算不同样品对DPPH自由基清除率(S)。

1．2．4 酵母源金属硫蛋白抑菌活性 无菌条件下挑取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与李斯特氏菌单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃进行传代培养，每隔12h传代一次，两次传代培养后，经观察菌落形态趋于一致并与典型菌落形态描述一致，可认为指示菌已获得纯培养［9］，符合后续实验要求。采用牛津杯法检测MT对致病菌的抑制效果。加热融化指示菌培养基，冷却后倒平板。待平板凝固后，均匀放入牛津杯。再将指示菌半固体培养基融化，冷却至45～50℃，把指示菌液先稀释至10-2后，吸取50μL接入指示菌半固体培养基中，倒平板。待平板凝固后将牛津杯拔出，在孔中加入50μL不同浓度MT样品溶液。30℃培养24h，观察有无抑菌圈产生，测量抑菌圈直径，绘制MT抑菌谱，其中每个样品设2个重复，抑菌圈直径取其平均值［10］。

2 结果与分析

2.1 酵母源金属硫蛋白对羟基自由基清除作用

MT对Cv-FeSO4-H2O2体系所产羟基自由基清除作用如图1所示，Zn-MT、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ和VC溶液对羟基自由基均有显著的清除效果，且具有良好的量效关系。与VC处理组比较，40～100μg/mL时，Zn-MT处理组对自由基清除效果极显著(p=0．0076＜0．01)，MT-Ⅰ(p=0．0127 ＜ 0．05)与 MT-Ⅱ(p=0．0191＜0．05)处理组对自由基清除效果显著，MT 对羟基自由基的清除能力约为VC3倍。当MT终浓度达到80μg/mL后，羟基自由基清除率达到峰值，80μg/mL以后清除效果趋于平缓。三种MT样品对羟基自由基的清除能力关系为Zn-MT＞MT-Ⅰ＞MT-Ⅱ。

图1 酵母源金属硫蛋白对羟自由基清除率Fig．1 The scavenging rate of metallothioneins from yeast on·OH

2.2 酵母源金属硫蛋白对超氧阴离子自由基清除作用

邻苯三酚在碱性条件下能够发生自氧化反应［11］，产生稳定浓度的超氧阴离子自由基与中间物，中间物又与超氧阴离子自由基反应，得到一种带有颜色的中间产物，此物在紫外有吸收，这为体外模拟机体超氧阴离子自由基并实时监测其数量提供可能性。本实验以邻苯三酚氧化体系成功模拟了机体超氧阴离子，同时测定Zn-MT、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ和VC溶液对超氧阴离子的清除作用。结果显示，四种样品对超氧阴离子均有较好的清除作用，随着样品浓度的升高，对超氧阴离子的清除率呈上升趋势，当样品浓度为100μg/mL时清除效果最好。在整个自由基清除过程中，当样品浓度达到60μg/mL后，与各MT处理组比较，VC溶液对超氧阴离子的清除效果最为显著(p=0．0069 ＜0．01)，三种 MT 样品对超氧阴离子的清除效果相当，结果见图2。

表1 酵母源金属硫蛋白对致病菌抑菌圈直径Table 1 The inhibitory zone of metallothioneins from yeast on pathogenic bacteria

图2 酵母源金属硫蛋白对超氧阴离子自由基清除率Fig．2 The scavenging rate of metallothioneins from yeast on

2.3 酵母源金属硫蛋白对DPPH自由基清除作用

DPPH作为一种稳定的固体自由基［12］，目前已被广泛用于生物试剂、抗氧化试剂和食品等抗氧化能力的定量分析。Zn-MT、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ和VC溶液对DPPH自由基清除作用如图3所示，四种样品对DPPH均有一定的清除效果，随着样品浓度的增加，三种MT样品对DPPH自由基的清除能力也逐渐增强，切呈剂量依赖关系，但VC溶液浓度达到60μg/mL后对DPPH的清除效果趋于稳定。当样品浓度达到80μg/mL后，Zn-MT与MT-Ⅰ对DPPH自由基的清除能力极显著高于VC(p＜0．01)，MT-Ⅱ对DPPH自由基的清除能力显著高于VC(p＜0．05)。相同浓度下，样品对DPPH自由基的清除能力关系为Zn-MT＞MT-Ⅰ ＞MT-Ⅱ ＞VC。

2.4 酵母源金属硫蛋白对三种致病菌抑制作用

图3 酵母源金属硫蛋白对DPPH自由基清除率Fig．3 The scavenging rate of metallothioneins from yeast on DPPH·

目前对金属硫蛋白的研究主要集中在提纯或抗氧化等功能活性的研究，对金属硫蛋白抑制致病菌方面还鲜有报道，实验选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与李斯特氏菌为指示菌，探讨MT对三种致病菌抑制作用。MT对三种致病菌抑菌圈直径如表1所示，目前对抑菌剂抑菌效果评价标准通常采用NCCLLS［13］所制定的:6～10mm 为低敏，10～15mm 为中敏，＞15～20mm为高敏，由此判定，在50～100μg/mL浓度范围内，Zn-MT对金黄色葡萄球菌与李斯特氏菌抑菌圈直径范围为 3．2～12．7mm，属于中敏级别，MT-Ⅰ添加量为150μg/mL时对金黄色葡萄球菌与李斯特氏菌抑菌圈直径为11mm，属于中敏级别;MT-Ⅱ对金黄色葡萄球菌与李斯特氏菌抑菌圈直径范围为3．6～6mm，属于低敏级别。实验同时发现，三种MT样品对大肠杆菌的抑菌效果均较差，近乎于无抑菌效果。

3 结论与讨论

经过近半个世纪的研究，金属硫蛋白作为强抗氧化功能活性物质已逐渐被人们所熟知，尤其是在医疗、美容、保健食品等方面的应用与开发引起国内外学者越来越多的兴趣。由于目前对金属硫蛋白的研究多数集中在动物源金属硫蛋白，而动物源金属硫蛋白在价格与提取率方面具有较大的局限性，所以本实验选取酵母源金属硫蛋白为实验材料，探讨不同异构形式酵母源金属硫蛋白与兔肝Zn-MT在体外清除自由基与抑菌活性方面的差异性。

实验结果表明，金属硫蛋白能够显著清除体外自由基，对于羟基自由基与DPPH自由基，金属硫蛋白的清除效果显著强于VC，但VC在清除超氧阴离子方面较金属硫蛋白表现效果更好。抑菌实验证明金属硫蛋白对金黄色葡萄球菌与李斯特氏菌具有一定的抑制作用，但对大肠杆菌的抑制作用不明显，这为金属硫蛋白的保健功能联合防腐功能在食品中的应用提供了新思路。与酵母源金属硫蛋白比较，兔肝Zn-MT无论在清除自由基或是抑菌方面效果较强，但差异性不大，这可能是因为本实验所选用金属硫蛋白纯度不足。由于金属硫蛋白家族庞大，异构体形式复杂，而通常所指的金属硫蛋白主要为MT-Ⅰ、MT-Ⅱ，因此本实验选取MT-Ⅰ与MT-Ⅱ两种异构形式进行研究，探讨金属硫蛋白在自由基清除与抑菌方面的构效关系。研究发现，在自由基清除与抑菌方面，MT-Ⅰ效果要好于MT-Ⅱ，该结果与已有报道相似［14］。

由于机体释放自由基方式复杂，且自由基种类不同，因此酵母源金属硫蛋白清除机体自由基的构效、量效关系及清除机制仍待进一步研究与阐述。但在本实验中，酵母源金属硫蛋白显示出了其强大的抗氧化能力及对部分致病菌的抑制作用，相信随着研究的深入，酵母源金属硫蛋白因其安全、经济及丰富的生物学功能将会在医药、化妆品、保健食品、生物防腐和环保等方面有着广阔的市场与发展前景。

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