周 婷,蒲 彪,姜欢笑,邓应钦
(四川农业大学食品学院,四川雅安625014)
藤椒,学名竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC Prodr.),又称竹叶椒,也叫野椒、山椒,俗称青花椒,属于花椒属下的花椒亚属,是重要的调味品,具有良好的开发和利用价值[1]。藤椒油是从藤椒籽和籽皮中提取的一种口味清爽、香味浓郁、麻味绵长的可食用植物油,具有藤椒特有的香麻味。其化学成分有挥发油、生物碱、脂肪酸、酰胺类物质、黄酮类物质、木脂素和香豆素等。四川洪雅藤椒油是本世纪初才新兴的一种调味料,具有独特的麻香风味。目前,四川洪雅县是全国规模最大的藤椒种植基地[2-3]。
花椒入药和调味,已为《本草纲目》和《中国药典》所记载,并为世人所知,其对神经系统、消化系统等具有重要作用,并具有解热镇痛、抗菌防腐等功效[4-5]。但是,目前对藤椒油的抗氧化能力的研究较少,而其抗氧化能力也是其应用必需的一个重要参数。本文通过建立体外抗氧化模型探讨冷榨藤椒油和溶剂萃取藤椒油的体外抗氧化活性,以进一步扩展藤椒的研究范围,以期为藤椒油的开发利用提供理论依据。
冷榨藤椒油(2013年7月21号生产)和鲜藤椒(2013年7月13号于四川省洪雅县采集),由四川洪雅县幺麻子食品有限公司提供;用冷榨技术生产的藤椒油称冷榨油,用溶剂萃取的藤椒油称溶剂油。
二苯代苦味胼基自由基(DPPH·)标准品 美国Sigma公司;抗坏血酸、BHT、无水乙醚、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、无水乙醇、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、过氧化氢、邻苯三酚、浓盐酸、七水合硫酸亚铁、水杨酸等 均为国产分析纯。
RE-86旋转蒸发仪 上海申胜生物技术有限公司;紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;500WHHS-2S电子恒温不锈钢水浴锅 上海光地仪器设备有限公司;180型电动粉碎机 广州市旭朗设备有限公司;DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱。
1.2.1 藤椒油的提取 准确称取30g粉碎至40目的藤椒粉末,装入500mL圆底烧瓶中,以无水乙醚为提取溶剂,料液比1∶10,浸泡30min后水浴加热,温度40℃,进行回流提取,时间2h(沸腾后计时),回流结束滤出提取液,向残渣中再加入300mL无水乙醚,重复提取2次,合并滤液,向滤液中加入适量的无水硫酸钠去除水分,过滤后用旋转蒸发器回收有机溶剂,所得的浸膏在通风厨中挥发剩余的有机溶剂至恒重[6]。
1.2.2 还原力测定
1.2.2.1 溶液配制 1% 铁氰化钾溶液:称取 1.0g 铁氰化钾,用蒸馏水溶解后定容至100mL,避光保存。
2.5mmol/L HCl溶液:称取 0.021mL 浓盐酸定容至100mL。
0.1%三氯化铁溶液:称取三氯化铁 0.05g,用2.5mmol/L HCl溶液溶解,定容至50mL,避光保存。
10%三氯乙酸溶液:称取10g三氯乙酸,用蒸馏水溶解后定容至100mL,避光保存。
0.2mol/L pH6.6 的磷酸盐缓冲液:取 0.2mol/L Na2HPO431.5mL 与 0.2mol/L NaH2PO468.5mL,混匀后,用 0.1mol/L 的 NaOH 及 HCl调节 pH 至 6.6。
50mg/mL藤椒油溶液:分别准确称取两种藤椒油5.00g,用丙酮定容至100mL,作为母液备用。
2mg/mL BHT 溶液:准确称取0.20g BHT,用丙酮定容至100mL,作为母液备用。
2mg/mL抗坏血酸溶液:准确称取0.20g VC,用蒸馏水定容至100mL,作为母液备用。
1.2.2.2 测定方法 将50mg/mL藤椒油溶液分别稀释成浓度为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0mg/mL的溶液,2mg/mL BHT溶液和2mg/mL抗坏血酸溶液分别稀释成 0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.10mg/mL的溶液,分别取2mL一定浓度的样品溶液于试管中,依次加入 2.5mL 0.2mol/L pH6.6 的磷酸盐缓冲溶液、2.5mL 1%铁氰化钾溶液,充分混合并摇匀,将混合溶液放入50℃水浴锅中保温20min后快速冷却,再加入2.5mL 10%三氯乙酸,充分混匀后,在低速离心机中,以3000r/min转速离心10min。取离心样液的上清液5mL,再加5mL蒸馏水和1mL 0.1%三氯化铁,充分混匀,在室内静置10min后在700nm处测吸光值A[7-8]。同时以BHT和抗坏血酸做对照。
1.2.3 清除羟自由基(·OH)能力的测定
1.2.3.1 溶液配制 8.8mmol/L H2O2:取 30%(w/w)H2O249.88mg,用蒸馏水定容至 50mL,4℃避光保存。
9.0mmol/L Fe2+(FeSO4·7H2O):称 取 FeSO4·7H2O 250.218mg,用蒸馏水定容至 100mL。
9.0mmol/L水杨酸-乙醇溶液:称取水杨酸124.308mg,用无水乙醇定容至 100mL。
1.2.3.2 测定方法 将50mg/mL藤椒油溶液分别稀释成浓度为 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0mg/mL的溶液,2mg/mL BHT溶液和2mg/mL抗坏血酸溶液分别稀释成 0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液,分别在10mL的试管中依次加入1mL 9mmol/L的FeSO4溶液,1mL不同浓度的样品溶液,1mL 8.8mmol/L 的H2O2溶液,摇匀,静置10min,再加入1mL 9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液,摇匀,水浴锅加热至37℃反应30min,于510nm处测其吸光值。在考虑到样品本身的吸光值影响,分别加入1mL FeSO4溶液、不同浓度的样品溶液和水杨酸-乙醇溶液、以及1mL蒸馏水作为样品的本底吸收值[9-10]。同时以BHT和抗坏血酸做对照。
羟自由基清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100
Ax:反应体系吸光度 Fe2++样品+H2O2+水杨酸;Ax0:样品本底吸光度 Fe2++样品+蒸馏水+水杨酸;A0:空白对照 Fe2++样品溶剂 +H2O2+水杨酸。
1.2.4 清除 DPPH·能力的测定
1.2.4.1 溶液配制 0.2mmol/L DPPH·溶液:称取DPPH 20mg,用无水乙醇溶解后定容至250mL,4℃避光保存。
1.2.4.2 测定方法 将50mg/mL藤椒油溶液分别稀释成浓度为 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0mg/mL的溶液,2mg/mL BHT溶液和2mg/mL抗坏血酸溶液分别稀释成 0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液,分别在10mL的试管中加入2mL 0.2mmol/L DPPH·溶液,2mL不同浓度的样品溶液,混匀后,避光静置 30min,于 517nm 处测吸光值[11]。同时以BHT和抗坏血酸做对照。
DPPH·清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100
Ax:2mL DPPH·溶液+2mL样品溶液(加入样液后DPPH·混合液吸光度);Ax0:2mL样品溶液+2mL无水乙醇(本底吸光度);A0:2mL DPPH·溶液+2mL样品溶剂(未加样液的DPPH·吸光度)。
[7]禤燕庆、寇广增、蔡海龙:《农业产业化联合体新型经营主体联合经营的新探索——基于安徽调查》,《农村经营管理》2017年第10期。
1.2.5.1 溶 液 配 制 10mmol/L HCl 溶 液:称 取0.084mL 浓盐酸稀释至100mL。
50mmol/L(pH8.2)Tris-HCl缓冲液:取 2.5g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于蒸馏水中,加浓盐酸0.8mL,定容至 100mL。
3mmol/L邻苯三酚溶液:称取0.0189g邻苯三酚(焦性没食子酸)用10mmol/L HCl溶液溶解定容至50mL。现配现用,4h内有效。
1.2.5.2 测定方法 将50mg/mL藤椒油溶液分别稀释成浓度为 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0mg/mL的溶液,2mg/mL BHT溶液和2mg/mL抗坏血酸溶液分别稀释成 0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液,分别取1mL一定浓度的样品溶液于试管中,各加入 4.5mL 50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液、4.7mL双蒸水,于25℃下恒温反应25min。取出试管后立即滴加0.3mL邻苯三酚(25℃下预热),摇匀,用紫外分光光度计测量滴加邻苯三酚后第100s时在325nm处的吸光值[12-13]。同时以BHT和抗坏血酸做对照。
超氧阴离子清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/(A0-A)]×100
Ax为Tris-HCl+样品液+双蒸水+邻苯三酚;Ax0为Tris-HCl+样品液+双蒸水;A0为Tris-HCl+双蒸水+邻苯三酚;A为Tris-HCl+双蒸水+HCl(0.3mL,10mmol/L)。
一种物质清除自由基能力的大小跟还原能力的大小是分不开的,在Fe3+-Fe2+氧化还原体系中,有颜色变化,所以可以通过显色反应来判断还原程度,反应后吸光度越大,还原能力越强,其抗氧化能力也越强[14]。
由图1、图2可知,在一定的质量浓度范围内,BHT、VC、冷榨油和溶剂油的还原力都随其质量浓度的增加而明显增大。在相同浓度下,溶剂油的还原力强于冷榨油,但与BHT和VC相比,其还原力比较弱,质量浓度为2mg/mL的冷榨油和溶剂油的还原力与质量浓度为0.05mg/mL的VC的还原力相当。实验表明,冷榨油和溶剂油具有一定的抗氧化活性。
图1 藤椒油的还原力Fig.1 Reducing power of Zanthoxylum armatum DC Prodr.Oil
本实验采用水杨酸比色法,利用H2O2和Fe2+混合发生Fenton反应,产生大量高反应活性的羟自由基,其能被水杨酸捕捉,并伴随产生有色物质,该物质在510nm处有最大吸收峰,具有清除羟自由基作用的物质存在时,会与水杨酸竞争,从而使有色产物生成量减少,吸光度降低。
图2 BHT和VC的还原力Fig.2 Reducing power of BHT and VC
由图3、图4 可知,BHT、VC、溶剂油和冷榨油对·OH具有良好的清除效果,且清除作用随质量浓度的增加而逐渐增强,呈较明显的剂量效应关系。在1~11mg/mL浓度范围内,溶剂油对·OH的清除率要高于同质量浓度的冷榨油,体系中3mg/mL的溶剂油清除率达75%,而同浓度的冷榨油仅达43%。当溶剂油质量浓度达到9mg/mL时,对·OH清除率达到89.79%,其清除效果高于1mg/mL VC对·OH(清除率71.82%)清除效果;BHT、VC、溶剂油和冷榨油对·OH的 IC50值分别为 0.9203、0.6470、1.9606 和 4.0675mg/mL。表明溶剂油和冷榨油对·OH具有一定的清除作用,但溶剂油具有更高的·OH清除能力。
图3 藤椒油对羟自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effects of Zanthoxylum armatum DC Prodr.Oil on hydroxyl free radicals
图4 BHT和VC对羟自由基的清除能力Fig.4 Scavenging effects of BHT and VC on hydroxyl free radicals
DPPH·是一种稳定的自由基,其结构中含有1个孤对电子,其不同浓度的乙醇溶液呈不同程度的紫色,并在517nm附近有强吸收峰,自由基清除剂能与孤对电子配对,使溶液颜色由紫色向黄色变化,在517nm处的吸光度也随之变小,而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈一定的相关性[15]。
由图5、图 6 可知,在 0.2~1.0mg/mL 浓度范围内,VC对DPPH·清除率基本无变化,都大于94%,BHT、溶剂油和冷榨油随质量浓度的增加,对DPPH·清除率逐渐增大,表现出良好的剂量依赖关系。溶剂油对DPPH·清除率高于同浓度的冷榨油,当溶剂油质量浓度达到11mg/mL时清除率达到86.87%,同质量浓度下冷榨油清除率为50.93%,远高于1mg/mL BHT清除率(44.51%)。溶剂油和冷榨油对DPPH·的 IC50值分别为 2.9465mg/mL 和 10.3052mg/mL。表明冷榨油和溶剂油具有良好的清除DPPH·能力,但溶剂油对DPPH·清除作用更明显。
图5 藤椒油对DPPH·的清除能力Fig.5 Scavenging effects of Zanthoxylum armatum DC Prodr.Oil on DPPH·radicals
图6 BHT和VC对DPPH·的清除能力Fig.6 Scavenging effects of BHT and VCon DPPH radicals
采用邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚在碱性条件下迅速发生自氧化,生成有色中间产物和,而生成的又对其自氧化起催化作用,中间产物的积累在滞后30~40s与时间呈良好的线性关系,一般能维持4min左右,随后减慢。有色中间物生成量的多少受的浓度影响,清除能减少有色产物的生成量,由此可测定该自由基清除剂清除的能力[16]。
由图7、图8可知,BHT、VC、溶剂油和冷榨油对O2-·都具有良好的清除效果,在 2.0~11.0mg/mL 浓度范围内,冷榨油和溶剂油对清除率相差不大,随质量浓度的增加增大不明显,均大于68%,与0.6mg/mL BHT和VC的效果相当。BHT、VC、溶剂油和冷榨油对的 IC50值分别为 0.4293、0.3934、1.6053mg/mL和0.5415mg/mL。表明冷榨油和溶剂油具有较好的清除能力。但冷榨油对清除作用更明显。
图7 藤椒油对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.7 Scavenging effects of Zanthoxylum armatum DC Prodr.Oil on superoxide anion radicals
图8 BHT和VC对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.8 Scavenging effects of BHT and VC on superoxide anion radicals
采用体外抗氧化模型,以VC和BHT为阳性对照,评价冷榨藤椒油和无水乙醚提取的藤椒油的抗氧化能力。研究结果表明,质量浓度为11mg/mL的溶剂油对·OH、DPPH·、的清除率分别为84.63%、86.87%、78.26%;质量浓度为 11mg/mL 的冷榨油对·OH、DPPH·、的清除率分别为65.98% 、50.93% 、80.93%。冷榨油和溶剂油的还原能力随其质量浓度的增加而增强,对·OH、DPPH·、清除率随质量浓度的增加而增大,呈现了良好的剂量效应关系;冷榨油对·OH、DPPH·、的 IC50值分别为 4.0675、10.3052 和0.5415mg/mL;溶剂油对·OH、DPPH·、的 IC50值分别为 1.9606、2.9465 和 1.6053mg/mL。当溶剂油质量浓度达到9mg/mL时,对·OH清除率达到89.79%,其清除效果高于1mg/mL VC对·OH(清除率71.82%)清除效果;当溶剂油质量浓度达到11mg/mL时,对 DPPH·清除率达到86.87%,远高于 1mg/mL BHT 清除率(44.51%)。
综上所述,藤椒油具有良好的体外抗氧化能力,是一种有效的抗氧化剂。
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