绿色木霉生产β-葡聚糖酶的产酶条件的优化

黄发 吴志娜

β-葡聚糖作为植物和大部分真菌细胞壁的一种成分,是植物光合作用的主要多糖类产物, 也是地球上一种非常丰富的可再生资源。β-葡聚糖酶已经广泛应用于工、农、兽、医等许多方面, 并且取得了一定的成绩。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 TU1800PC紫外分光光度计, 日本岛津；LRH 恒温恒湿培养箱, 广东省医疗器械厂；数显恒温水浴锅,国华电器有限公司；快速混匀机, 金坛市华峰仪器有限公司；高压灭菌锅, 日本HIRAYAMA公司。试剂均为分析纯。

1.2 菌种、培养基及培养条件 绿色木酶3.3744的原菌种购于中科院微生物研究所。保藏时间：在20℃室温下2个月移接1次, 4℃左右可以3～4个月移接1次。采用斜面培养基用于菌株的转移和保藏;用马铃薯培养基进行扩大培养；基础固体发酵培养基, 基础液体产酶培养基用于绿色木霉产酶培养条件的研究。培养温度为28℃, 时间是5～7 d。

1.3 溶液的配制 昆布多糖溶液(g/L)：昆布多糖5 g, 蒸馏水1 L。DNS试剂(3, 5-二硝基水杨酸)(g/L)：酒石酸钾钠200 g, 3, 5-二硝基水杨酸10 g, 氢氧化钠20 g, 苯酚2 ml, 无水亚硫酸钠2.5 g, 于棕色瓶中避光保存, 放置1周后使用。乙酸-乙酸钠缓冲溶液缓冲溶液(g/L)：0.2 mol/L冰乙酸溶液：冰乙酸11 ml, 加水至1000 ml；0.2 mol/L乙酸钠溶液：CH3COONa·3H2O 27.22 g, 加水至1000 ml。使用时将上述两种溶液按体积比2：3混合即得到乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

1.4 葡萄糖标准曲线绘制 选用DNS在碱性条件下与还原糖反应, 生成有色化合物, 然后通过分光光度计进行比色测定, 确定低分子糖的量［1］。配制0.1 g/100 ml的标准葡萄糖溶液(1 mg/ml), 取6支写有编号的具塞试管(25 ml), 在每一支试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml配制好的标准葡萄糖溶液, 然后加入蒸馏水到1 ml, 得到不同浓度的葡萄糖溶液。然后每个试管中加入DNS试剂3 ml, 在沸水中反应15 min, 冷却后定容到25 ml, 在550 nm下测OD值。

1.5 绿色木霉产β-葡聚糖酶活力测定 采用还原糖测定法测定绿色木霉产β-葡聚糖酶活力。将原始菌种接种于斜面培养基, 在30℃培养3 d, 连续活化几代。从活化的斜面上刮取孢子, 接入带玻璃珠的无菌水中, 充分震荡, 分散孢子。调节孢子悬浮液的浓度至106～107个/ml, 即可用于固体和液体培养接种。取固体发酵曲2 g, 加入蒸馏水20 ml(10倍),40℃水浴浸提1 h, 不断搅拌, 用虑纸过滤, 滤液4000 r/min离心15 min。去除孢子, 上轻液即为酶液。液体取适当发酵液,6层纱布过滤, 滤液4000 r/min离心15 min, 用乙酸-乙酸钠缓冲溶液适当稀释即得粗酶液。

1.6 绿色木霉产β-葡聚糖酶固体培养和液体培养条件的优化包括以下几个方面。

1.6.1 最佳氮源筛选 以硫酸氨、氯化氨、硝酸氨、磷酸氢二氨作为筛选氮源。将含不同氮源的培养基装入三角瓶中,每个三角瓶以3：2的麸皮：秸秆的碳源1.5 g, 加入1.5×106个/ml 的孢子1 ml, 每种氮源进行3次平行试验, 29 ℃培养4 d,测定酶活性。

1.6.2 最佳碳源筛选 氮源采用“1.6.1”试验中的最佳氮源,固体培养基的碳源采用麸皮：秸秆分别是1：4、2：3、3：2、4：1共5 g(液体培养基中碳源采用麸皮：秸秆分别是1：0.3：2、0：1共1.5 g和玉米粉1.5 g)。将含不同碳源的培养基装入三角瓶中, 每个三角瓶加入5.8×106个/ml的孢子1 ml, 每种碳源进行3次平行试验, 29℃培养65、112、140 h(液体培养基中培养时间分别为：59、112、184 h)分别测定酶活性。

1.6.3 最佳培养时间的筛选 采用“1.6.1”、“1.6.2”试验中的最佳氮源、碳源进行培养, 29℃培养, 时间分别定为65、112、140 h(液体培养基中培养时间分别为：59、112、184 h)。

1.6.4 最佳培养pH值的筛选 pH值设为3、4、5、6四个实验组, 采用“1.6.1”、“1.6.2”、“1.6.3”试验中得到的最佳氮源、碳源和培养时间, 29℃条件下培养, 接种量为1.6×106个/ml。每个试验做3个平行试验, 测定酶活性。

2 实验结果

2.1 根据DNS法得到的葡萄糖溶液标准曲线, 公式为Y=0.419X-0.014, r2为 0.960。

2.2 固体产酶培养条件优化结果

2.2.1 采用固体培养时, 供试的四种氮源中最佳氮源是(NH4)2HPO4, 将绿色木霉培养4 d后, 其β-1, 3-葡聚糖酶的酶活可达1643 U/ml。其次是(NH4)2SO4, 将绿色木霉培养4 d后,其β-1, 3-葡聚糖酶的酶活可达1638 U/ml。

2.2.2 采用固体培养时, 供试的四种碳源中最佳碳源是麸皮：秸秆=3：2。将绿色木霉培养4 d后, 其β-1, 3-葡聚糖酶的酶活性可达381 U/ml。

2.2.3 酶活性随着时间的增加而增大, 根据绿色木霉的生长条件以及营养的消耗程度可以推测出它的活性最大值应出现在150 h以后。

2.2.4 产酶活在pH值>3, <4的时候, 随着pH值的增加,产酶活性在下降, 到pH=4时达到最低, 之后逐渐升高, 当pH=6时, 最高可达725 U/ml, 但该上升趋势仍在进行, 结合“2.1.1”的结果(该试验条件的pH值接近中性), 可以推测绿色木霉产β-1, 3-葡聚糖酶的最适pH应在中性可偏碱性范围内。

2.3 液体产酶培养条件优化结果 最佳氮源是(NH4)2SO4, 将绿色木霉培养4 d后, 其β-1, 3-葡聚糖酶的酶活可达315 U/ml；液体培养的最佳碳源是麸皮。将绿色木霉培养4 d后, 其β-1,3-葡聚糖酶的酶活可达166 U/ml；绿色木霉液体培养的最佳产酶时间是135 h左右, 其β-1, 3-葡聚糖酶的酶活可达998 U/ml；绿色木霉液体培养最佳产酶pH值是5.5左右, 其β-1, 3-葡聚糖酶的酶活可达890 U/ml。

3 讨论

一般来说, 无论是液体发酵或者是固体发酵, 它们在发酵过程中都会有一定的酸化, 而液体对这种酸化更敏感, 但是由于它对培养基的初始pH值依赖性更大, 所以, 当它的初始pH值过于中性时, 它的产酶活性就会减少, 而当它的初始pH值过于酸性时, 当然, 这本身就是对培养基的一种毒害,所以产酶活性也不会太高, 所以液体的产酶活性最佳pH值在5.5左右, 是有一定道理的。

本文研究探讨了绿色木霉产β-葡聚糖酶的固体培养和液体培养的条件。得出以下条件：①固体培养的最佳条件为：培养温度为29℃, 氮源为(NH4)2HPO4, 碳源采用麸皮：秸秆=3：2, 培养时间为150 h, 培养pH值为7.0；②液体培养的最佳条件为：培养温度为29℃, 氮源为(NH4)2SO4, 碳源为麸皮, 培养时间为135 h, 培养pH值为5.5。本研究对于提高绿色木霉产β-葡聚糖酶水平具有研究意义, 为大规模应用于工、农、兽、医等方面提供了重要基础。