高糖诱导大鼠视网膜微血管周细胞Ang－2／Tie－2系统表达改变及牛磺酸的防护效应研究＊

曾凯宏，明 建，杨 娜，余雪梅，宋 怡，王 静，杨咏涛

1.四川省医学科学院·四川省人民医院 营养科（成都 610072）；2.西南大学 食品科学学院（重庆 400715）；3.四川省医学科学院·四川省人民医院 实验动物研究所（成都 610212）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病患者最常见的眼部并发症，视网膜微血管周细胞（retinal microvascular pericytes，RMPS）从微血管壁上丢失是DR最早发生的血管细胞损伤事件［1，2］，但丢失机制尚不清楚。血管生成素（angiopoietin，Angs）是新近发现的与血管生成密切相关的一族蛋白分子，Ang－1和Ang－2是其最主要的两个成员，Tie－2是二者共同的酪氨酸激酶受体。研究［3］发现，与正常对照相比，糖尿病3w大鼠视网膜内Ang－2蛋白表达量上调37倍。另有研究［4］发现，Ang－2过表达与视网膜周细胞凋亡关系密切。近年来大量研究［3，4］证实，Ang－2／Tie－2系统与 DR早期RMPS丢失关系密切。

牛磺酸是存在于膳食中的一种人体半必需氨基酸，在糖尿病患者视网膜内通过抗氧化、抗凋亡、抑制谷氨酸兴奋毒性等作用而发挥DR的保护作用［5－9］。本研究通过建立体外培养的大鼠 RMPS高糖模型，观察高糖和牛磺酸对 RMPSAng－2／Tie－2系统表达的影响，探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的分子机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

出生后3～5d的SD大鼠10只，由四川省人民医院实验动物研究所提供；牛磺酸为Sigma公司产品；PDGFR－β抗体、抗酪氨酸磷酸化的单克隆抗体（PY20）、desmin抗体、vimentin抗体、荧光抗体FITC和罗丹明购于Sigma公司；荧光定量PCR试剂及ELISA试剂盒均购于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用免疫磁珠结合传统的胶原酶消化及筛网过滤法培养RMPs，取材前先采用磁分离器制备PDGFR－β抗体包被的免疫磁珠。分离视网膜，剪碎后过100μm滤网，离心洗涤后加入5倍体积0.1%－型胶原酶，30min后过55μm滤网，收集单细胞悬液，离心后加PDGFR－β抗体包被的免疫磁珠。30min后置于磁分离器上，磁珠聚集后反复洗涤至上清液不含细胞和多余磁珠，接种，细胞长满瓶底80%消化传代，3～6代用于实验。

1.2.2 细胞鉴定 用RMPs特征性标志物desmin和vimentin联合，免疫细胞荧光双标鉴定。免疫细胞化学双染步骤为：细胞爬片以40g／L多聚甲醛固定30min，PBS漂洗5min×3次，用含10g／L BSA，5mL／L TritonX－100的 PBS缓冲液孵育30 min，同前漂洗后，用含50～100mL／L正常羊血清的PBS缓冲液孵育10min，加1∶1 000稀释的Anti－desmin，4℃过夜（同时设PBS替代一抗的空白对照和正常羊血清替代一抗的替代对照），PBS漂洗后与罗丹明标记的荧光二抗37℃孵育30 min，PBS漂洗后加1∶1 000稀释的 Antivimentin，37℃，2h，PBS漂洗后与FITC标记的荧光二抗37℃孵育30min，PBS漂洗后加Hoechst 33342于37℃孵育5min，PBS缓冲液漂洗后，900 mL／L甘油封片，激光共聚焦显微镜观察并照相。

1.2.3 实验分组 实验共分为10组，分别是：正常对照组（Con，5mM D－glucose）、低剂量牛磺酸对照组（Con＋0.1mM Tau）、中剂量牛磺酸对照组（Con＋1mM Tau）、高剂量牛磺酸对照组（Con＋10mM Tau）、甘露醇渗透对照组（Con＋mannitol）、高糖组（HG，25mM D－glucose）、低剂量牛磺酸干预高糖组（HG＋0.1mM Tau）、中剂量牛磺酸干预高糖组（HG＋1mM Tau）、高剂量牛磺酸干预高糖组（HG＋10mM Tau）、甘露醇高糖对照组（HG＋mannitol）。

1.2.4 基因表达检测 采用实时荧光定量PCR法（qRT－PCR）检测 Ang－2和 Tie－2基因表达，分别设计Ang－2和Tie－2基因引物以及TaqMan荧光探针（由大连宝生物公司合成）。引物序列为：Ang－2：forward 5′－TGGGATTTGGTAACCCTTCA－3′，reverse 5′－GTAAGCCTCATTCCCTTCCC－3′；Tie－2：forward 5′－GGTTCCTTCATCCATTCAGTGC C－3′，reverse 5′－CAGTTCACAAGCCTTCTCAC ACG－3′；RPL13A：forward 5′－AAGCCTACAAG AAAGTTTGCCTATC－3′，reverse 5′－TGTTTC CGTAGCCTCATGAGC－3′。用常规酚／氯仿法提取大鼠RMPS的mRNA，进行qPCR反应，反应体系25μL：2×TaqMan University PCR混合液12.5 μL，10μmol／L 正反向引物各 0.5μL，10μmol／LTaqMan探针0.3μL，100ng／μL DNA0.2μL，同时设立内对照RPL13A基因，反应在ABI Prism 7000荧光定量PCR仪上进行。反应条件为：93℃2min，93℃1min，55℃1min，共40个循环。采用低循环数（Ct）比较法计算目的基因的相对拷贝数与表达量。

1.2.5 蛋白表达检测 采用ELISA检测试剂盒检测 Ang－2、Tie－2以及磷酸化 Tie－2蛋白表达。培养的RMPs加入裂解缓冲液在4℃ 反应30min，用Bradfore法测定蛋白浓度，Ang－2和 Tie－2表示为ng／mg总蛋白。为了检测磷酸化Tie－2水平，培养RMPs的经细胞裂解物免疫沉淀处理后，用抗酪氨酸磷酸化的单克隆抗体（PY20）在4℃下孵育1.5 h，随后加入蛋白A／G琼脂糖在4℃过夜，然后用RIPA缓冲液洗涤后，以12 000g离心20min。沉淀物用1mL含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液在65℃重新悬浮5min，以破坏蛋白质－蛋白质相互作用，随后用ELISA检测P－Tie－2水平。

1.3 统计学方法

应用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，数据用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养的RMPS形态及鉴定

光镜下观察结果和姬姆萨染色结果显示：原代培养的大鼠RMPS形态不规则，呈多角形，通过RMPS特征性标志物desmin和vimentin进行免疫细胞荧光双标并用激光共聚焦显微镜显示，细胞核用Hoechst 33342染料进行复染，结果发现：培养体系所有细胞desmin和vimentin免疫染色呈阳性（见图1），因此认为该培养体系的细胞为RMPS。

图1 大鼠RMPs形态及鉴定

2.2 牛磺酸抑制高糖诱导的RMPs Ang－2上调表达

通过实时定量PCR和ELISA检测技术检测RMPs Ang－2基因和蛋白表达，结果显示：与正常对照组相比，25mM高糖培养组Ang－2基因和蛋白表达量明显增加，0.1mM、1mM和10mM牛磺酸干预高糖组Ang－2基因和蛋白表达量比高糖未干预组明显降低，呈剂量依赖关系。

与高糖未干预组相比，0.1mM牛磺酸干预高糖组Ang－2基因表达量下降1.3倍，1mM牛磺酸干预高糖组Ang－2基因表达量下降1.6倍，10mM牛磺酸干预高糖组Ang－2基因表达量下降2.7倍。

与高糖未干预组相比，0.1mM牛磺酸干预高糖组Ang－2蛋白表达量下降1.3倍，1mM牛磺酸干预高糖组Ang－2蛋白表达量下降1.6倍，10mM牛磺酸干预高糖组Ang－2蛋白表达量下降1.8倍。0.1mM、1mM和10mM牛磺酸干预对正常对照组RMPs Ang－2基因和蛋白表达无明显影响，甘露醇渗透对照不改变RMPs Ang－2基因和蛋白表达（见图2）。

图2 牛磺酸抑制高糖诱导的RMPs Ang－2上调表达

2.3 牛磺酸抑制高糖诱导的RMPs Tie－2下调表达

25mM高糖培养24h后，Tie－2基因表达量明显降低，比正常对照组降低67%，与高糖未干预组相比，1mM和10mM牛磺酸干预高糖组Tie－2基因表达量明显增加。高糖培养24h后，Tie－2蛋白表达量也明显低于正常对照组，1mM和10mM牛磺酸干预高糖组Tie－2蛋白表达量明显高于高糖未干预组。0.1mM、1mM和10mM牛磺酸干预对正常对照组RMPs Tie－2基因和蛋白表达无明显影响，甘露醇渗透对照不改变RMPs Tie－2基因和蛋白表达（见图3）。

图3 牛磺酸抑制高糖诱导的RMPs Tie－2下调表达

2.4 牛磺酸抑制高糖诱导的RMPs磷酸化Tie－2下调表达

利用ELISA检测技术检测高糖培养12、16、20和24h后磷酸化Tie－2（P－Tie－2）水平，高糖培养12h开始，P－Tie－2水平明显低于正常对照组，高糖培养20 h组P－Tie－2水平降到最低值，培养24h时，P－Tie－2水平有一点升高，但与高糖培养20h组相比无明显差异。1mM和10mM牛磺酸干预高糖组P－Tie－2水平明显高于高糖未干预组。0.1mM、1mM和10 mM牛磺酸干预对正常对照组P－Tie－2水平无明显影响，甘露醇渗透对照不改变P－Tie－2水平（见图4）。

3 讨论

研究已证实，DR时RMPS是最早被影响的血管细胞。RMPS的募集和覆盖是血管生成、成熟和维持的重要环节，RMPS功能失调与视网膜的许多疾病相关，如DR［3］。糖尿病早期RMPS从微血管壁上丢失，随后血管内皮细胞亦丢失，剩下无细胞、无灌注的毛细血管，毛细血管无灌注可刺激病理性新生血管生成［4］。糖尿病患者在初期眼部并无自觉症状，但当眼部出现明显症状时，视网膜病变已很严重，丧失了最佳治疗时机［2］。若在DR早期病理性新生血管生成之前及早采取防护措施，将能产生阻止DR进展的理想效果。

图4 牛磺酸抑制高糖诱导的RMPs磷酸化Tie－2下调表达

牛磺酸作为人体的条件必需氨基酸，其与视损伤的防护早已被人们关注。研究［10－12］发现，猫膳食中缺乏牛磺酸时会导致视网膜疾病，灵长类动物试验中也得到了同样的结论；孕妇膳食缺乏牛磺酸时会导致母子视网膜疾患，膳食中补充牛磺酸时症状消失。笔者自2000年以来开展了对牛磺酸防护各种原因致视损伤的系列研究，通过体内外实验［9］发现，牛磺酸对DR视网膜Müller细胞损伤、视网膜光化学损伤、缺氧诱导的视网膜损伤以及视网膜谷氨酸兴奋毒性均有明显防护效应。但综合既往研究发现，有关牛磺酸防护DR主要集中在神经细胞和血管内皮细胞上，对RMPS防护机制方面的研究鲜有报道。

本研究通过建立体外培养的大鼠RMPS高糖模型发现：高糖培养后，大鼠RMPs中Ang－2表达量明显增加，Tie－2以及磷酸化Tie－2水平明显降低，牛磺酸干预可明显降低高糖组Ang－2表达，明显增加高糖组Tie－2以及磷酸化Tie－2水平，呈剂量依赖关系。上述结果提示：牛磺酸保护糖尿病引起视损伤的机制可能与其降低RMPs中Ang－2表达、增加RMPs中Tie－2以及磷酸化Tie－2水平有关。

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