加味小苦辛汤对博来霉素肺纤维化小鼠肺组织病理形态学、肺系数及HYP含量的影响

王 亮 曾红兰 周远航 董亚威 徐荣谦

（北京中医药大学东直门医院，北京100700）

加味小苦辛汤对博来霉素肺纤维化小鼠肺组织病理形态学、肺系数及HYP含量的影响

王 亮 曾红兰 周远航 董亚威 徐荣谦*

（北京中医药大学东直门医院，北京100700）

目的 观察加味小苦辛汤对博来霉素 （BLM）致肺纤维化小鼠肺组织病理形态学及羟脯氨酸 （HYP）含量的影响。方法 将C57BL-6小鼠70只随机分为正常组、模型组、强的松组、加味小苦辛低剂量组、加味小苦辛汤高剂量组5组，每组14只 （每组再随机分2批，每批7只）。小鼠腹腔注射BLM造模。各药物组于造模成功后第2日起每日连续给予相应药物。给药第14，28日分批随机处死小鼠。观察4各组病理切片肺组织形态学改变，计算肺系数和肺组织HYP的含量。结果 空白组小鼠肺组织无纤维化形成；模型组肺组织可见肺泡破坏，肺泡间隔大量纤维化，肺系数值及肺组织中HYP含量较空白组显著增高 （P＜0.01）。各治疗组肺组织纤维化程度较模型组明显减轻，且肺系数值和HYP含量较模型组显著降低 （P＜0.01）。结论 加味小苦辛汤可显著降低博来霉素致肺纤维化小鼠的肺泡炎程度与肺纤维化程度，并且可以抑制造模状态下PF小鼠肺组织中HYP含量的异常增高。

肺纤维化；加味小苦辛汤；博来霉素；小鼠

肺纤维化 （PF）的病理实质是某些病理因素诱发肺损伤持续进行，继而导致细胞外基质代谢紊乱，肺成纤维细胞和以胶原蛋白为主的细胞外基质成分在肺泡和间质内沉积及纤维组织过度修复造成肺组织结构的紊乱［1］。本病较多见于成人，亦可在婴幼儿及儿童中发生，最小可见于4个月婴儿，起病多隐匿，发病＜6个月者，病程多为急性，为6个月至2岁者可为急性或慢性，为≥2岁者多为慢性，在儿童发病率较低，但近年来亦有上升趋势［2］。

本课题是在恩师徐荣谦教授多年临床、科研工作的基础上，根据刘弼臣名老中医辛开苦降法治疗小儿间质性肺炎的经验，加减化裁而成的加味小苦辛汤，具有疏邪祛痰、降气化瘀之功。临床已初步证实加味小苦辛汤确有改善儿童肺纤维化临床症状的疗效，为进一步探讨其治疗博来霉素致肺纤维化小鼠的作用机制，选择了肺系数、肺组织病理学切片HE染色、Masson染色和为胶原纤维所特有的羟脯氨酸 （HYP）的含量等指标，来反映胶原的沉积和肺纤维化程度的改变。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雌性C57BL／6小鼠，70只，体质量15～17g，北京维通利华实验动物有限公司提供，动物质量合格证：SCXK（京）2012-0001。饲养于清洁级标准环境中，实验期间小鼠自由饮水、进食。

1.1.2 药物与试剂 博来霉素 （BLM），日本化药株式会社制造 （生产批号：Y20262，进口药注册证号：H20090885）。加味小苦辛汤由黄芩、黄连、干姜、半夏等组成，免煎颗粒由北京康仁堂药业有限公司制作提供，每1g相当于原药材量10g。醋酸泼尼松片，河南天方药业股份有限公司生产 （批号110630550）。羟脯氨酸测试盒由南京建成生物工程研究所提供，批号：20130423。

1.2 方法

1.2.1 分组方法 实验动物随机分为5组，每组14只，分别为空白对照组、模型组、强的松组、加味小苦辛汤高剂量组 （4.6g／kg）和加味小苦辛汤低剂量组 （1.15g／kg）。

1.2.2 造模与给药方法 造模除空白对照组外，其余四组均按照李丽娜等［3］的方法建立模型，分别于实验0、2、4、6、8天于腹膜腔注射BLM（40mg／kg）200μl×5次，空白对照组注入等体积生理盐水。造模成功后第2天起，中药高剂量组、中药低剂量组每天用加味小苦辛汤 （剂量分别为10mg／kg／d、30mg／kg／d）灌胃一次，强的松组每天用醋酸泼尼松龙注射液 （6.67mg／kg／d）灌胃一次，空白对照组、模型组每天用生理盐水 （10ml／kg）灌胃一次，直至取材日期。

1.2.3 标本采集 于给药后第14，28日分批处死小鼠，每次每组7只。开胸分离出双肺，取右肺中叶置于4%甲醛溶液中固定，常规石蜡切片。

1.3 主要观察指标

1.3.1 肺系数 造模后第14、28天称量小鼠体重、肺重，根据测量出的体重及肺重计算肺系数：肺系数=肺湿重 （mg）／体重 （kg）。

1.3.2 组织病理学观察指标 肺组织切片HE染色，参照Szapiel［4］等的方法确定肺泡炎的程度分为4级：无肺泡炎 （-）；轻度肺泡炎 （+），表现为单核细胞浸，使肺泡隔增宽，仅限于局部和近胸膜部，面积小于全肺的20%，肺泡结构正常；中度肺泡炎 （++）：受累面积占全肺的20%～50%，近胸膜部较重；重度肺泡炎 （+++）：呈弥漫性分布，病变范围大于50%。

肺组织切片Masson染色，参照Szapiel［4］等的方法将肺间质纤维化分为4级：无纤维化 （-）；轻度纤维化（+）：受累范围小于20%；中度纤维化 （++）：受累范围占全肺的20%～50%，肺泡结构紊乱；重度肺纤维化（+++）：受累范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。

1.3.3 HYP含量测定 采用样本碱水解法分别检测实验小鼠的肺组织羟脯氨酸 （HYP）的含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以±s）表示，用单因素方差分析及两两比较的q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺系数14天和28天的比较 造模14天时，各造模组小鼠肺系数与空白组比较均显著增加 （P＜0.01）；小苦辛汤高剂量组肺系数与强的松组比较有差异 （P＜0.05），与小苦辛汤低剂量组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）；小苦辛汤低剂量组肺系数与强的松组比较有差异 （P＜0.05）。造模28天时，各给药组小鼠肺系数与空白组、模型组比较均有显著差异 （P＜0.01）；小苦辛汤高剂量组肺系数与强的松组比较有差异 （P＜0.05）；小苦辛汤低剂量组肺系数与强的松组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），与小苦辛汤高剂量组比较有差异 （P＜0.05）。具体结果见表1。

表1 各组肺系数值 （x±s）

2.2 肺组织病理形态学影响的比较 见表2。

表2 五组小鼠14、28天肺泡炎和肺纤维化程度分级比较

2.3 肺组织中羟脯氨酸14天和28天含量的比较 造模14天时，各给药组小鼠肺组织HYP含量与空白组、模型组比较均有显著差异 （P＜0.01）；小苦辛汤高剂量组肺组织HYP含量与强的松组比较有显著差异（P＜0.01）；加味小苦辛汤低剂量组肺组织HYP含量与强的松组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），与加味小苦辛汤高剂量组比较有差异 （P＜0.05）。造模28天时，给药组小鼠肺组织HYP含量与空白组、模型组比较均有显著差异 （P＜0.01）；加味小苦辛汤高剂量组肺组织HYP含量与强的松组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）；加味小苦辛汤低剂量组肺组织HYP含量与强的松组比较有差异 （P＜0．05），与加味小苦辛汤高剂量组比较有显著差异（P＜0.01）。具体结果见表3。

表3 各组小鼠肺组织HYP含量 （x±s）

3 讨论

特发性肺纤维化是一种原因不明的、进行性的、局限于肺部的以纤维化伴蜂窝状改变为特征的疾病，它是特发性间质性肺炎中的常见类型。近20余年，其发病率增加，治疗乏策，生存期中位数2.9年，5年生存率＜50%，几乎与恶性肿瘤无异［5］。目前，肺纤维化确切的发病机制仍不是很清楚，西医西药临床疗效欠佳，主要使用皮质激素类、免疫抑制剂和细胞毒性药物。其中糖皮质激素是治疗PF的首选传统药物，但是长期服用糖皮质激素引发明显的副作用，且特异性差。

肺系数是反映肺纤维化程度、肺实变的最直观指标之一，其数值高低与肺质量和体质量关系密切。博来霉素诱导动物的肺间质纤维化模型在早期以肺泡炎为主，后期以间质纤维化改变为主［6］。动物造模后，早期由于疾病状态引起体质量增长缓慢，有的甚至出现体质量的持续下降，均成为肺系数升高的直接原因。肺系数的高低与肺质量密切相关，从形态学分析，炎性渗出、细胞水肿、毛细血管充血等因素是肺系数升高的直接原因，诸因素均可造成肺质量增加［7］。本实验观察到，小苦辛汤高剂量、低剂量和强的松组均可以降低小鼠肺系数，但小苦辛汤高剂量组较其余两者效果稍为明显。

肺纤维化是多种原因引起慢性肺疾病的共同结局，其病理改变以大量的成纤维细胞聚集、细胞外基质沉积并伴有炎症和损伤所致组织结构破坏为特征［8］。肺成纤维细胞是肺内胶原的主要合成细胞，而肺组织HYP的含量与胶原含量之间具有较确定的数量关系［9］。因此，研究肺组织HYP含量的表达变化可以反映确定肺纤维化的程度。本实验观察到，各模型组肺组织HYP含量均明显高于空白组，小苦辛汤高剂量组肺组织HYP含量明显降低，表明小苦辛汤高剂量可以抑制BLM造模状态下肺纤维化小鼠肺组织中HYP含量。

恩师徐荣谦教授认为儿童肺纤维化发病的内因主要责之小儿正气不足；外因责之于非时之感。正气不足为本病之本，同时感受外邪，“虚”、“郁”、“痰”、“瘀”贯穿于疾病的始终，其基本病机为本虚气郁，痰阻血瘀并存［10］。加味小苦辛汤由刘弼臣教授 “小苦辛汤”与五虎汤 （《医宗金鉴·幼科心法要诀》）两方加减而成，是徐荣谦教授在历代先贤及刘弼臣教授“辛开苦降”的经验基础上变化而来［11］。方中半夏辛温，入脾胃肺经，可燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结，《别录》：“消心腹胸隔痰热满结，咳嗽上气”；干姜辛热，入脾胃心肺经，可温中散寒，温肺化饮，《本经》：“主胸闷咳逆上气”，黄芩、黄连皆为苦寒之品，功可清热燥湿、泻火解毒，其中黄芩力偏于上焦，可用于肺热咳嗽，正如 《珍珠囊》：“泻肺火上逆”［12］。多年来，恩师在中医 “郁非辛不开，火非苦不降”的理论指导下，以辛开苦降法治疗儿童肺纤维化，使顽痰得清，瘀滞的通，肺气得宣，病情得缓，在临床上取得了一定的疗效。而本研究则通过实验证明：加味小苦辛汤可抑制BLM造模状态下肺纤维化小鼠肺组织中HYP含量和肺系数值的异常增高，同时可以改变其病理形态学。

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［12］张晶洁，徐荣谦．辛开苦降法在儿童闭塞性细支气管炎治疗中的应用［J］．吉林中医药，2012，（2）：133-135．

Ob s e r v e t h e In f l u e n c e o f Mo di fie d Xia o k u xin De c o c tio n o n t h e L u n g Tis s u e Mo r p h ol o g y、Lu ng Co e f ficien t an d HYP o f Pulmona r y Fib r o sis Mic e In d u c e d b y Ble omy cin

Wang Liang Zeng Honglan Zhou Yuanhang Dong Yanw eiXu Rongqian✫
（Dongzhimen Hospital'Beijing University of Chinese M edicine'Beijing'100700'China）

Objective To observe the influence of Modified Xiaokuxin decoction on the lung tissue morphology，lung coefficient and HYP of pulmonary fibrosis mice induced by bleomycin（BLM）．Methods Mice were randomly divided into 5 groups：control group，model，group，prednisone group，low-dose of Modified Xiaokuxin decoction group and high-dose of Modified Xiaokuxin decoction group，n=14（each group were randomly divided into 2 batches，each batch of 7）．Mice model was made by intraperitoneal injection of BLM A5．Mice were daily administrated with corresponding drugs after the day of modeling．The mice were killed after 14 and 28 days'consecutive administration．The shape of mouse'lung tissues was observed，lung coefficient and the levels of hydroxyproline in lung tissues were measured．Results There was no pulmonary fibrosis in the control group，in the model group，a large number of alveolus damaged，alveolar septum fibrosis．numerical value of lung coefficient and the levels of HYP were significantly higher than that in the control group（P＜0.01）．In the treatment groups，lung fibrosis was siginificantly alleviated；numerical value of lung coefficient and the levels of HYP were significantly lower than in the model group（P＜0.01）．Conclusion Modified Xiaokuxin decoction has the effect of anti-inflammatory and anti-fibrosis on fibrosis mice induced by bleomycin and can inhibit the content of abnormally high levels of HYPin PF lung tissue in the state of modeling．

Pulmonary fibrosis；Modified Xiaokuxin Decoction；bleomycin；hydroxyproline；mice

doo：10.3969／j.issn.1672-2779.2014.08.098

1672-2779（2014）-08-0001-02

*通讯作者

杨 杰 本文校对：

2013-12-27）