中药清热利湿饮对HaCaT细胞周期的影响

范玉 ，杜锡贤 ，张春红 ，张晓杰 ，王国颖 ，周爱妍

（1.山东中医药大学附属医院，济南250011；2.山东大学第二医院，济南250033；3.潍坊医学院附属医院，潍坊261000；4.山东大学齐鲁儿童医院，济南250022）

银屑病是一种具有遗传倾向的以角质形成细胞异常分化、增殖为特征的慢性炎症性疾病，在银屑病皮损区表皮基底细胞增生加速，有丝分裂周期缩短，表皮通过时间由28 d缩短为3～4 d[1]。本研究采用肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导活化HaCaT细胞，体外模拟银屑病皮损角质细胞异常增殖的病理特征，进一步探讨中药清热利湿饮对HaCaT细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人永生化表皮细胞HaCaT细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；甲基噻唑基四唑(MTT)（美国Sigma公司）用时以PH值为7.2、浓度为0.01 mol/L的PBS配制成5 g/L，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用。碘化丙啶（PI）染料（美国Sigma公司）；Annixin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（B&D公司）；甲氨喋呤(MTX)（广东岭南制药有限公司）；rhTNF-α（PEPROTECH公司），10 μg/支比活≥2×107U/mg，蒸馏水溶解 10 mg/L（2×108U/L），-20℃冻存备用；流式细胞分析仪及软件（美国B&D公司FAC scalibur）；Biorad 550酶标仪（美国Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1 清热利湿饮组成及药液的制备 清热利湿饮由金银花30 g、土茯苓30 g、龙胆草9 g、黄芩9 g、栀子 9 g、紫草 15 g、连翘 15 g、生地黄 15 g、牡丹皮15 g、赤芍 15 g、板蓝根 30g、车前子 15 g、泽泻 9 g、当归9 g、柴胡9 g、甘草9 g组成。

精确称定上述中药药材1 680 g，加10倍量水16 800 mL浸泡30 min，煮沸后继续煎煮45 min，过滤药液待用。将药渣加8倍量水13 440 mL同法煎煮30 min过滤，合并两次的滤液，用65%乙醇醇沉24 h，回收乙醇至无醇味，浓缩至每毫升相当于原药材2 g的清热利湿饮提取液，0.22 μm超滤膜过滤除菌，4℃冰箱冷藏保存备用，细胞培养时用无血清DMEM培养液配制成不同浓度，并将其PH值调到7.0。

1.2.2 MTT比色法测定TNF-α对HaCaT细胞增殖的影响 HaCaT细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液（CM）传代培养。取对数生长期的HaCaT细胞用胰酶消化，吹打成单个细胞悬液，吸入50 mL塑料离心管中，1 000 r/min×10 min，离心，弃上清，CM重悬细胞，调细胞浓度为2×107/L，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，100 μL/孔，将96孔板置37℃、体积分数为5%CO2孵箱孵育过夜，使其贴壁，分别将已稀释的TNF-α加入各相应孔中，100 μL/孔，TNF-α 浓度分别为 1×106μ/L、5×105μ/L、2.5×105μ/L、1.25×105u/L、0.62×105μ/L 和0.31×105μ/L，并设无TNF-α空白CM对照孔，每个药物浓度均为6复孔，分别培养24 h、48 h和72 h后加5 g/L的MTT 10 uL/孔，继续培养4 h，吸弃上清100 μL/孔，加入体积分数为10%的SDS 100 μL/孔过夜，使MTT的还原产物甲臜充分溶解，采用酶联免疫检测仪测定各孔570 nm处的OD值，按下列公式计算细胞的增殖率：增殖率=处理组OD值均数/空白对照组OD值均数×100%

1.2.3 流式细胞仪检测清热利湿饮提取液对HaCaT细胞周期的影响（PI单染色法） 取对数生长期的HaCaT细胞常规消化后接种于100 mL细胞培养瓶中，细胞浓度为1×107/L，37℃、体积分数为5%CO2孵箱孵育过夜，使其贴壁，次日加入TNF-α终浓度为2.5×105u/L，诱导培养48 h后分别加入MTX和清热利湿饮提取液，MTX终浓度为5 mg/L,清热利湿饮提取液浓度分别为 15，12.5，10，7.5，5g/L，常规培养48 h后，弃上清，PBS洗一次，用体积分数为0.25%的胰酶消化5 min，加入PBS轻轻吹打，获取单个细胞悬液，吸入50 mL离心管中，1 000 r/min，离心10 min，弃上清，加入PBS，将细胞吸入2 mL的EP管中，0.01 mol/L洗2次，弃上清，加入-20℃预冷的70%的乙醇1 mL，次日用PBS再洗2次，弃上清，PBS 调细胞浓度为 2×1010/L，取细胞悬液 50 μL，加入含RNA酶A的PI染色液500 μL/管，4℃避光染色20 min，上机检测。

2 结果

2.1 不同浓度不同时相TNF-α对HaCaT细胞增殖的影响 采用MTT比色法观察24，48，72 h TNF-α对HaCaT细胞增殖效应的影响。不同浓度的TNF-α分别对HaCaT细胞诱导24，48，72 h，与无TNF-α细胞对照组相比，具有一定的增殖活化效应，且这种效应随着作用时间的延长亦有增强的趋势，本研究选择48 h以上作为TNF-α对HaCaT细胞的诱导时间。不同浓度的TNF-α对HaCaT细胞增殖的影响：TNF-α 活性单位为 1×106u/L和 5×105u/L时与HaCaT细胞的增殖呈负相关，即浓度越高其细胞活化效应越弱，推测可能是本研究应用的TNF-α剂量过大对细胞产生了细胞毒作用，导致细胞的增殖活性降低。在TNF-α为2.5×105u/L时HaCaT细胞增殖接近14.11%，达峰值。经TNF-α诱导后细胞轮廓清晰，状态良好，与未处理组相比增殖速率较快，具有较高的细胞密度和活力。结果表明，在一定的浓度范围内，TNF-α的浓度与HaCaT细胞的增殖呈明显的剂量依赖关系，故本研究选择2.5×105u/L作为对HaCaT细胞的诱导剂量。见表1和图1。

2.2 清热利湿饮提取液对HaCaT细胞周期的影响

本研究显示：MTX阳性对照组对HaCaT细胞作用48 h，G1期细胞为65.94%，正常对照和TNF-α对照组分别为49.01%和50.73%，前者高于后者，而S期前者为30.38%，后者为48.22%和46.35%，表明MTX将细胞阻滞于G1期，使其不能进入S期，见图2～4和表2。中药清热利湿饮提取液在低浓度时，G1期和S期细胞与TNF-α组相比无明显变化，而在12.5 g/L和15 g/L时，G1期细胞与TNF-α组相比细胞明显减少（38.06%和 25.04%），S期细胞为56.98%和67.90%，比TNF-α对照组增加10.63%和21.55%，表明12.5 g/L和15 g/L清热利湿饮可使活化的HaCaT细胞周期发生明显改变，见图5～9。

3 讨论

HaCaT细胞是正常突变的永生化人角质形成细胞株，增生活跃，有丝分裂增多，具有永生性和与角质形成细胞相似的增殖、分化特性。遗传特性稳定，不具有成瘤性[2]。张云璧等[3]研究发现，TNF-α（100 U/孔）能够刺激角质形成细胞生长并对其分泌细胞因子IL-8具有促进作用。

表1 不同时相不同浓度TNF-α对细胞增殖的影响增殖率 （n=6,±s）%

表1 不同时相不同浓度TNF-α对细胞增殖的影响增殖率 （n=6,±s）%

组别 24 h 48 h 72 h 10×105 μ/L 101.67±3.05 103.60±2.69 106.12±2.65 5×105 μ/L 105.00±4.20 108.27±1.84 111.33±3.79 2.5×105 μ/L 109.17±5.28 113.43±4.25 114.11±2.97 1.25×105 μ/L 102.50±3.79 107.66±4.09 108.99±3.05 0.62×105 μ/L 100.83±1.01 104.12±4.37 104.45±1.67 0.31×105 μ/L 96.67±3.96 98.15±3.53 99.56±1.19空白对照组 100.00±4.01 100.00±2.78 100.00±3.02

图1 TNF-α诱导前后细胞形态

表2 清热利湿饮提取液对HaCaT细胞周期的影响(±s)

表2 清热利湿饮提取液对HaCaT细胞周期的影响(±s)

注:与 TNF-α 组比较，*P<0.05；与 MTX 组比较，△P<0.05。

组别正常细胞组TNF-α组MTX组中药5 g/L中药7.5 g/L中药10 g/L中药12.5 g/L中药15 g/L n 3 3 3 3 3 3 3 3细胞百分率（%）G0/G1 S G2/M 49.01±4.01 48.22±2.03 2.77±1.10 50.73±5.32 46.35±5.76 2.92±0.51 65.94±4.84 30.38±1.25 3.68±0.87 57.85±2.08 39.85±4.04△ 2.30±0.30 49.22±2.07 47.35±4.34△ 3.43±1.87 46.59±4.30 49.57±3.93△ 3.84±0.19 38.06±3.52* 56.98±6.91*△ 4.96±0.13 25.04±0.98* 67.90±3.12*△ 7.06±1.67

图2 正常细胞组

图3 TNF-α组

图4 MTX组

图5 中药5 g/L组

图6 中药7.5 g/L组

图7 中药10 g/L组

图8 中药12.5 g/L组

图9 中药15 g/L组

本次实验就TNF-α对HaCaT细胞作用的不同浓度和时相进行了观察，研究发现，在TNF-α为2.5×105u/L时HaCaT细胞增殖达峰值，而在1.25×105u/L至0.31×105u/L时，随着TNF-α活性单位的降低，其增殖效应逐渐减弱。得出结论：在一定的范围内，TNF-α的浓度与HaCaT细胞的增殖呈明显的剂量依赖关系。为了进一步模拟银屑病的病理过程，造成角质形成细胞过度增殖模型，作者选择TNF-α对HaCaT细胞进行诱导，并把诱导剂量定为2.5×105u/L。在 TNF-α 为 2.5×105/L时，HaCaT细胞的增殖率与无TNF-α的对照组相比增加了14.11%，提示经TNF-α诱导后HaCaT细胞与银屑病表皮细胞的生物学特性更接近。

何彦德[4]应用中药凉血活血复方（大青叶15 g、生地 30 g、黄芩 12 g、紫草 9 g、丹参 12 g、赤芍 6 g、丹皮9 g、当归12 g、土茯苓30 g、白藓皮9 g、荆芥 6 g、双花20 g）进行了体外细胞实验。结果显示不同浓度的凉血活血复方作用于HaCaT细胞48 h，G2/M期细胞百分比与对照组相比明显增加，G1期百分比减少，细胞阻滞于G2/M期，且随着药物浓度增加G2/M期比例不断上升，G1期比例不断减少。

本文对细胞周期的实验结果显示：MTX阳性对照组对HaCaT细胞作用48 h，G1期细胞为65.94%，S期为30.38%，表明MTX将细胞阻滞于G1期，干扰了DNA的合成，使其不能进入S期；MTX作为细胞内二氢叶酸还原酶的竞争抑制剂，造成DNA合成障碍，杀伤处于S期的细胞[5]。清热利湿饮浓度为12.5 g/L和15 g/L时，G1期细胞与TNF-α组相比细胞明显减少，S期细胞比TNF-α组增加了10.63%和21.55%。本研究提示虽然较高浓度的清热利湿饮与MTX两种药物对HaCaT细胞周期的敏感时相不同，MTX将HaCaT细胞阻滞于G1期，S期细胞比率下降，清热利湿饮提取液则将大量细胞阻滞于S期，影响了细胞向G2/M期的过渡，严重干扰了细胞进入下一增殖周期，但两种药物都是通过干扰细胞周期某一时相的生物合成而抑制细胞的异常分裂和过度增殖[6-8]。

[1]万永山,张开明.角质形成细胞在银屑病发病中的再认识[J].中国麻风皮肤病杂志,2008,24（1）：45-47.

[2]Conrad C,Boyman O,Tonel G,et al.Alpha1beta1 integrin is crucial for accumulation of epidermal T cells and the development of psoriasis[J].Nat Med,2007,13:836-842.

[3]张云璧,瞿幸,牛福玲,等.常用治疗银屑病的中药对TNF-α刺激后角质形成细胞生长及分泌白介素8的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2006,5（1）:18-20.

[4]何彦德.中药凉血活血复方治疗银屑病的临床和实验研究[D].大连医科大学,2008:15.

[5]封绍奎,雷鹏程,万俊增.皮肤性病学[M].北京：中国协和医科大学出版社,2000:339.

[6]Lowes MA,Bowcock AM,Krueger JG.Pathogenesis and therapy of psoriasis[J].Nature,2007,445:866－873.

[7]Boukamp P,Petrussevska RT,Breitkreutz D,et al.Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line[J].J Cell Biol,1988,106:761-771.

[8]Bianchi L,Farrace MG,Nini G,et al.Abnormal Bcl－2 and“tissue”transglutaminase expression in psoriatic skin[J].J Invest Dermatol,1994,103:829－833.