5种“发物”对小鼠变应性接触性皮炎模型的影响

胡阳 ，孙越 ，李婷 ，陈向明 ，张海清 ，俞爱华 ，王国江

（1.上海市嘉定区南翔医院，上海201802；2.上海市交通大学附属第一人民医院，上海200080）

中医文献中“发物”多指辛辣、海鲜、荤腥厚味食物[1]，此类食物可能是导致变态反应性皮肤病加重、反复难愈的因素之一[2]。中医将容易激发宿疾复发或加重现有疾病的食物称为“发物”，且十分重视对“发物”的忌口。但由于缺乏客观指标，“发物”忌口的科学性常受到质疑。变应性接触性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）是接触性变应原引起的一种Ⅳ型变态反应，是临床常见的炎症性皮肤病。本研究利用2，4-二硝基氟苯（DNFB）诱导 BALB/c小鼠ACD模型，观察羊肉、带鱼、青椒、香菇、竹笋5种传统“发物”对其皮肤损害及相关细胞因子的影响，并探讨可能的作用机制，从而对传统中医“发物”理论进行实验论证，为临床指导患者合理的饮食提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄SPF级雌性BALB/C小鼠,体质量18～22 g（上海斯莱克动物中心提供）。实验动物合格证号：scxk（沪）2008-0016。在一定的温度和湿度环境中适应性喂养1周进行实验。

1.2 实验试剂 DNFB（上海化学试剂公司），丙酮（上海试剂厂）。小鼠γ-干扰素（IFN-γ），白细胞介素（IL-17）ELISA试剂盒（美国R&D公司，上海科兴生物公司代购，批号20121102）。

1.3 实验仪器 电子分析天平（精确度0.1 mg，上海精密科学仪器有限公司FA1004），皮肤圆形打孔器（直径 8 mm），光学显微镜（OLYMPUS B×43F）及成像系统（micropublisher3.3RTV，QIMAGING ROHS，CANADA）。BIO-TEK 酶标仪（型号 ELX-800）。

1.4 实验分组及方法 78只小鼠随机分成羊肉组、带鱼组、香菇组、青椒组、竹笋组、对照组、正常组，前6组每组12只小鼠，参照文献[3]制作经典ACD小鼠模型。实验前1 d，腹部剃毛，面积约3 cm2，实验1 d和2 d分别在去毛部位涂0.5%DNFB（溶剂为丙酮∶橄榄油＝4∶1的混合液）20 μL各致敏 1次，实验6 d在小鼠右耳内外侧涂0.2%DNFB 10 μL，激发ACD。左耳涂等量丙酮橄榄油基质作对照。正常组6只小鼠为健康小鼠。羊肉、竹笋、带鱼、青椒、香菇各500 g，煎煮浓缩至2 g/mL，分别对相应组别小鼠进行灌胃，首次灌胃于激发前1 d，1次/d，每次量以0.02 mL/g计算。对照组用等量纯水灌胃。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 耳厚度 分别于激发后24，48 h处死小鼠，用直径8 mm的打孔器，分别钻取左右耳中部的组织，将钻下耳组织制成HE染色切片。参照文献[4]在光学成像显微镜100倍镜下，采用Q-capture pro7图像处理软件，测量组织切片中距耳缘端4 mm处的耳双面距离,垂直于软骨进行测量，每只耳测量5次，取平均值，计算激发后小鼠左、右耳厚度差。

1.5.2 真皮单一核及多形核细胞总数 将钻取的右耳组织制成HE染色切片，每张HE切片在光镜显微镜400倍镜下，取5个不重叠视野，进行炎症细胞数量计数，取平均值。

1.5.3 外周血IFN-γ、IL-17检测 分别于激发后24，48 h摘眼球取血1 mL，离心后分离血清，低温冰箱保存备用。ELISA法检测小鼠外周血IFN-γ、IL-17水平，检测步骤按试剂盒说明书进行，将反应板放入酶标仪于450 nm波长处测各孔吸光度值，通过标准曲线计算各孔IFN-γ、IL-17的浓度值（单位为 mg/L）。

1.6 统计学方法 采用graphpad prism 5统计软件对各组数据进行单因素方差分析，实验数据采用±s表示，“发物”各组与对照组及正常组间均数比较采用Dunnett-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耳厚度 激发后24 h，“发物”各组耳肿胀与对照组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）；激发后48 h，羊肉、青椒组耳肿胀较对照组显著增高（P＜0.05），带鱼、竹笋、香菇组与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

2.2 炎症细胞计数 与对照组比较，激发后24 h羊肉组耳组织炎症细胞计数明显增多（P＜0.05），激发后48 h，羊肉、青椒组炎症细胞均显著增多（P＜0.05），带鱼、竹笋、香菇组24 h及48 h与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1

表1 激发后24，48 h耳肿胀及炎症细胞计数 （±s）

表1 激发后24，48 h耳肿胀及炎症细胞计数 （±s）

注：*与对照组相比P＜0.05。

组别 n 耳肿胀（μm） 炎症细胞计数24 h 48 h 24 h 48 h对照组 6 179.03±26.84 177.73±24.64 112.89±24.59 119.24±18.04羊肉组 6 220.61±36.99 278.58±45.48*143.65±31.06*189.38±42.68*带鱼组 6 204.18±38.22 212.38±34.25 119.91±20.55 126.34±23.46香菇组 6 200.68±29.33 204.19±29.61 128.81±20.91 123.63±10.94青椒组 6 207.87±14.58 271.99±64.68*135.31±11.02 196.22±56.64*竹笋组 6 175.38±25.67 172.32±25.09 113.38±25.67 115.24±65.02 F值 2.45 11.54 3.84 28.63 P 值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 外周血IFN-γ、IL-17水平变化 与正常组相比，诱导小鼠ACD后，各组IFN-γ、IL-17均明显升高（P＜0.05）。与对照组相比，竹笋组 IFN-γ、IL-17 水平明显降低（P＜0.05），带鱼、香菇组两种细胞因子差异无统计学意义（P＞0.05），羊肉、青椒组 24 h差异无统计学意义（P＞0.05），48 h IFN-γ、IL-17 水平显著增加（P＜0.05）。见表 2。

表2 激发后24，48 h小鼠血清IFN-γ、IL-17水平变化

3 讨论

长期以来，皮肤病患者的饮食忌口很多，但大多是根据传统经验，或不明饮食禁忌，导致疾病加重，或盲目忌口造成营养失衡，免疫力下降，影响疾病的恢复。羊肉、带鱼、青椒、香菇、竹笋是常用食物，也是中医传统认为的“发物”。研究表明花生四烯酸、前列腺素等重要变应性活性介质是由n-6族脂肪酸转变而来，n-3不饱和脂肪酸在特应性发病中是一个有利的因素[5]。羊肉中含有花生四烯酸，海鲜中含有n-3不饱和脂肪酸。青椒中辣椒素可导致血管扩张等神经源性炎症效应。香菇多糖具有免疫调节作用。竹笋具有低脂肪、低糖、高纤维素等特点。本研究观察其对小鼠ACD模型的影响，并探讨可能的作用机制。DNFB腹部诱导，耳廓激发小鼠模型是目前最为常用的ACD动物模型，该模型可用于评估食品及其中成分对过敏性疾病的干预研究[6]。ACD是一种以炎症细胞浸润及组织变性坏死为主要病理特征的炎性反应。耳厚度及单位面积单一核及多形核细胞浸润数量变化是反应ACD严重程度的常用指标。从研究结果来看羊肉、青椒能明显加重小鼠耳廓炎症肿胀，增加局部炎症细胞浸润，48 h时尤为显著，表现出有加重小鼠ACD作用。带鱼、竹笋、香菇组对小鼠ACD炎症程度无明显影响。

ACD是T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应，研究证明Th1和Th17细胞在ACD的发病过程中均起重要作用。其各自分泌的IFN-γ和IL-17均为ACD效应阶段重要的细胞因子。IFN-γ是最有效的巨噬细胞激活因子，能活化多种细胞，调节多种免疫活性介质的合成和分泌，加重炎症反应。He等[7]研究发现 IFN-γ通过刺激和调节 ROS（Reactive oxygen species，ROS）的活性而影响ACD反应。IL-17能诱导角质形成细胞产生多种炎性因子（如IL-6、IL-8等），调节趋化因子 CXCL1及黏附分子ICAM-1表达，促进中性粒细胞活化和向炎症部位募集，加重局部炎症反应[7-8]。通过检测外周血细胞因子发现，激发ACD后各组IFN-γ、IL-17水平较正常小鼠均有不同程度的升高，并与ACD严重程度平行。与对照组相比，羊肉、青椒组48 h时IFN-γ、IL-17的释放明显增加，其加重小鼠ACD的作用可能与此有关。竹笋组2种细胞因子表达明显下降，但其对小鼠ACD炎症无抑制作用，是否与喂食时间及样本量有关，有待进一步研究。带鱼、香菇对两种细胞因子均无明显影响。

变态反应性皮肤病中医辨证多与血热，风热、湿毒有关，本研究结果显示，对此类疾病，羊肉、青椒温热性食物，与中医“发物”吻合。

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