顺铂对人结直肠癌细胞HCT-116中TOB1表达的影响

孙克康 仲 宁 沈晓军 杨 栋 刘 刚 甘明强 吴晓阳

(昆山市第一人民医院 江苏大学附属昆山医院心胸胃肠外科，江苏 昆山 215300)

结直肠癌发病率约占所有肿瘤的10% ～15%，手术治疗是首选的治疗方式〔1〕，但相当一部分患者确诊时已处于中晚期，因此化疗、辅助化疗成为结直肠癌重要的治疗手段。顺铂作为重要的化疗药物在结直肠癌的化疗中发挥重要的作用。ErbB2转录因子1(TOB1)基因是B细胞异位基因/erbB2转录因子(BTG/TOB1)抗增殖蛋白家族中研究最多的一个成员，大量的研究证实TOB1基因在抑制肺癌细胞恶性增殖、转移过程中发挥重要的作用〔2～4〕。本实验研究顺铂对结直肠癌HCT-116细胞中TOB1表达的影响，为TOB1的抗癌研究及结直肠癌临床化疗疗效判断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人结直肠癌细胞株HCT-116购自美国细胞收藏中心(American type culture collection)，由本室保藏。DMEM细胞培养基、0.25%胰酶、胎牛血清购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒、Go Taq Green Master Mix PCR扩增试剂盒购自美国Invitrogen公司，PCR反应试剂盒购自美国Promega公司，PCR引物采用Premier5.0软件设计，交由Invitrogen公司合成。实验所需其余试剂购自上海生物工程技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基，置于37℃、5%CO2条件下常规培养，每2 d换液1次，3 d传代1次。

1.2.2 RT-PCR检测TOB1对肿瘤转移相关基因表达的调控按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用DEPC水溶解RNA，紫外分光光度计分别测定RNA纯度(A260 nm/A280 nm＞1.80)。各取总RNA 5 μg，采用逆转录试剂盒进行第一链cDNA合成(详见逆转录试剂盒参考说明)。PCR所需引物序列见表1，反应条件参见文献〔5〕。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察、拍照。通过quantity one图像分析软件对各条带灰度进行检测，以内参GAPDH的灰度为标准，各组mRNA的灰度值与之相比。

表1 RT-PCR实验所需的引物名称及序列

1.2.3 Western印迹法检测TOB1对细胞转移和侵袭相关蛋白表达的调控 收集细胞，IP裂解液裂解，离心收集蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度。每组样品取50 μg总蛋白采用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，室温下以5%脱脂奶粉进行非特异性的抗原封闭1 h，随后加入特异性一抗溶液室温作用1 h，0.1%Tween PBS洗涤后与HRP耦联的二抗溶液室温作用1 h，洗涤后采用化学发光显色试剂盒进行曝光，同一张膜测定β-actin蛋白作为样品内参。抗TOB1(N-20)单克隆抗体稀释倍数1∶200，抗-Actin(C4)单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、驴抗羊IgG的稀释倍数均为1∶1 000。通过quantity one图像分析软件对各条带灰度进行检测，以内参-Actin的灰度为标准，各组蛋白的灰度值与之相比。

1.2.4 免疫荧光 胰酶消化处于指数生长期的细胞，按照一定的数量接种在0.14 mm厚的玻璃培养皿，(直径3.5 cm)，48 h用20 mol/L顺铂处理细胞，2 h后用 PBS洗3遍，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3 遍，每次5 min，0.2%曲拉通破膜30 min，PBS洗3遍，每次5 min，1%BSA 封闭，4℃避光过夜;加入TOB1一抗(1∶200)4℃避光过夜;PBS避光洗3遍，加入FITC标记的兔抗鼠 IgG(1∶500)4°C避光1 h，PBS避光洗3遍，每次5 min，加入DAPI避光30 min，PBS避光洗3遍，每次5 min，加入防淬灭封闭液。采用激光共聚焦显微镜观察488激光激发下绿色荧光。所有实验均重复3次以上。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行t检验和方差分析。

2 结果

2.1 不同剂量顺铂对TOB1 mRNA和蛋白表达水平的影响不同剂量顺铂处理后TOB1 mRNA表达水平与对照组相比均明显增加(P＜0.05)，并且TOB1的表达水平随顺铂剂量增加呈逐渐增加趋势;不同剂量的顺铂处理后TOB1蛋白的表达水平比对照组明显增加(P＜0.05)，同时TOB1蛋白表达水平随顺铂剂量增加逐渐增加，见图1。

2.2 顺铂处理后不同时间TOB1 mRNA和蛋白表达水平的变化 20 μmol/L顺铂处理2 h后TOB1 mRNA表达水平即开始增加(P＜0.05)，照射24 h后仍保持较高的表达水平;顺铂处理2 h后TOB1蛋白的表达水平明显增加(P＜0.05)，照射24 h后仍保持较高的表达水平，见图2。

2.3 顺铂诱导HCT-116细胞中TOB1向细胞核转位 HCT-116细胞中TOB1主要分布在细胞质，而20 μmol/L顺铂处理2 h后HCT-116细胞中TOB1主要分布在细胞核;说明顺铂处理后早期可诱导HCT-116细胞质中TOB1向胞核内转位，见图3。

图1 不同剂量顺铂对TOB1 mRNA和蛋白表达水平的影响

图2 顺铂处理后不同时间TOB1 mRNA和蛋白表达水平的变化

图3 顺铂对TOB1细胞内分布的影响

3 讨论

结直肠癌的发生、发展以及肿瘤细胞的浸润转移是一个多因素、多步骤的复杂过程，抑癌基因的失活在其中发挥着重要的作用。目前结直肠癌的早期诊断率还比较低，大多数患者在确诊时已属中晚期，且手术后的患者中仍有50%以上会出现复发或转移。化疗是治疗晚期或复发转移的结直肠癌的主要手段，多年来顺铂是治疗结直肠癌最主要的化疗药物之一。近年来，由于分子生物学技术的发展，对结直肠癌分子机制的研究不断深入，部分肿瘤标志物及靶基因在治疗前后表达水平的变化对判断肿瘤短期疗效及预后中有重要意义。

TOB1是1996年日本学者Matsuda在筛选与erbB2相互作用的蛋白时首次发现，因此被命名为erbB2转导因子1。TOB1基因定位于染色体17q21，编码含345个氨基酸的蛋白质分子〔6〕。由于TOB1基因在细胞静止期和抗细胞增殖中发挥重要的作用，其表达和功能的改变往往引起细胞的恶性进展，因此成为肿瘤学研究新的热点〔7〕。本研究证实了顺铂可以诱导结直肠癌HCT-116细胞中TOB1的表达，并可以诱导细胞质中TOB1向细胞核内转位，提示TOB1具有作为临床结直肠癌化疗靶基因的可能，该基因的靶向研究可能对肺癌临床化疗疗效的判断具有一定的指导作用。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2011;61(2);69-90.

2 Winkler GS.The mammalian anti-proliferative BTG/Tob protein family〔J〕.J Cell Physiol，2010;222(1):66-72.

3 O'malley S，Su H，Zhang T，et al.TOB suppresses breast cancer tumorigenesis〔J〕.Int J Cancer，2009;125(8):1805-13.

4 Tzachanis D，Boussiotis VA.Tob，a member of the APRO family，regulates immunological quiescence and tumor suppression〔J〕.Cell Cycle，2009;8(7):1019-25.

5 Jiao Y，Ge CM，Meng QH，et al.Adenovirus-mediated expression of Tob1 sensitizes breast cancer cells to ionizing radiation〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2007;28(10):1628-36.

6 Jiao Y，Sun KK，Zhao L，et al.Suppression of human lung cancer cell proliferation and metastasis in vitro by the transducer of ErbB-2.1(TOB1)〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2012;33:250-60.

7 Park GT，Seo EY，Lee KM，et al.Tob is a potential marker gene for the basal layer of the epidermis and is stably expressed in human primary keratinocytes〔J〕.Br J Dermatol，2006;154(3):411-8.