美洛昔康对慢性铝过负荷致神经元退变大鼠脑内金属离子含量的影响

苏 强 杨俊卿 唐 捷 (南充市中心医院药学部，四川 南充 637000)

流行性病学调查研究结果提示，人类摄入铝的途径中95%主要来自于食物，而只有不到1%的量来自于空气中粉尘铝〔1〕。长期饮用含铝浓度较高的水，AD 发病率明显升高〔2〕。长期接触大剂量的铝可造成机体多个组织器官损害，并引起严重的CNS毒性，表现为行为认知功能障碍、中枢神经元损伤乃至神经元退行性变，但其机制仍未彻底阐明。通过脑室给铝，可使铝异常沉积于脑皮层各区以及海马，导致动物学习记忆功能的损害和神经元退变〔3〕，但此脑损伤应为急性损伤;同时脑室给铝方式与临床铝经口摄入途径有很大差异，属于有创性模型，因而有学者认为其还不能称为严格意义上的神经元退变模型。因此，在本研究中采用大鼠长期灌胃给予铝盐的方法建立神经元退变动物模型，并以此模型研究美洛昔康对慢性铝过负荷致神经元退变大鼠脑内金属离子含量的影响，期望从另一个视角探讨慢性铝过负荷致大鼠神经元退变与脑内金属离子的关系。

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂 清洁级雄性Wistar大鼠40只，质量220～250 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证书号SCXK(渝)20020003。六水三氯化铝(国产分析纯)，葡萄糖酸钠(国产分析纯)，等离子体原子发射光谱检测(解放军后勤工程学院进行)。

1.2 方法

1.2.1 慢性铝过负荷致神经元退变大鼠模型的建立 实验动物在实验条件下饲养3 d以适应实验环境。将实验动物分为4组，每组10只大鼠，即正常对照组、慢性铝过负荷模型组、美洛昔康3 mg/kg组和美洛昔康1 mg/kg组。称取17.9 g AlCl3·6 H2O及9.9 g葡萄糖酸钠溶于一定量双蒸水中，待溶液清澈后用0.1 mol/L NaOH将溶液滴定到pH 6.0左右，用双蒸水定容至100 ml，配制成含Al3+20 g/L的葡萄糖酸铝溶液，慢性铝过负荷模型组大鼠灌胃给予葡萄糖酸铝(Al3+200 mg·kg-1·d-1)，每周5 d，连续20 w;正常对照组大鼠灌胃给予与药物等体积的0.3%羧甲基纤维素钠;美洛昔康1、3 mg/kg组在每次给予铝盐后30 min灌胃给予，每周灌胃5 d，连续20 w，灌胃体积为10 ml/kg。所有动物有关的实验与操作均在学校道德与伦理委员会的指导和许可下进行。在20 w模型制备过程中，铝盐毒性造成部分大鼠死亡。

1.2.2 金属离子测定 取-80℃冰箱保存的大鼠脑组织称重，加入2 ml双蒸水，匀浆，按8 ml/g脑湿重加入25%四乙基氢氧化铵溶液，80℃消化24 h至溶液澄清，加双蒸水定容到10 ml，测定时用双蒸水稀释5倍。为了避免金属离子的干扰，所有过程均采用一次性塑料试管。金属离子含量采用等离子体原子发射光谱分光光度仪测定，用内标法直接测定，测定波长分 别 为:铝 309.3 nm，铁 238.2 nm，铜 224.7 nm，锌206.2 nm。

2 结果

慢性铝过负荷模型组中金属离子含量(铝、铁、铜、锌)明显高于正常对照组，与模型组相比，美洛昔康给予能明显降低大鼠海马中金属离子含量，与美洛昔康1 mg/kg组相比，美洛昔康3 mg/kg组大鼠海马中金属离子含量降低更为明显，差异有统计学意义(P ＜0.05，P ＜0.01)。见表1。

表1 美洛昔康对慢性铝过负荷大鼠脑组织金属离子含量的影响( s，n=3)

表1 美洛昔康对慢性铝过负荷大鼠脑组织金属离子含量的影响( s，n=3)

与对照组比较:1)P ＜0.05;与模型组比较:2)P ＜0.05，3)P ＜0.01;与美洛昔康小剂量组比较:4)P ＜0.05

组别 铝(μg/g)铁(μg/g)铜(μg/g)锌(μg/g)21.53 ±2.90 31.09 ±1.87 3.37 ±0.99 3.92 ±0.73铝盐模型组 61.17 ±9.251) 88.97 ±13.981) 10.09 ±0.921) 9.77 ±0.941)美洛昔康大剂量组 41.68 ±1.152)4) 43.32 ±2.852)4) 6.42 ±0.883) 6.37 ±0.453)4)美洛昔康小剂量组 46.46 ±2.242) 56.57 ±4.502) 7.65 ±0.452) 7.39 ±0.252)空白对照组

3 讨论

众所周知铝具有明显的神经毒性，鉴于铝中毒涉及学习记忆障碍和有文献报道AD患者脑内铁代谢失衡〔4〕，人们推测铝的神经毒作用可能与影响脑铁的代谢有关，但这种关系缺乏有力的直接证据。

在本实验研究中，笔者采用长期灌胃给铝的方法建立了神经元退变大鼠模型，结果发现与正常对照组大鼠相比，慢性铝过负荷大鼠空间学习记忆能力明显损害，同时，大鼠两侧海马出现明显的核固缩，细胞层次明显减少，这与脑室给予铝盐、一氧化碳中毒等致脑损伤的海马形态学改变特点相似〔5〕。结合大鼠行为学、病理学变化，笔者认为本研究中长期灌胃给予葡萄糖酸铝，可以导致大鼠神经元退变，而与脑室给铝模型相比，更能模拟临床摄入铝致人神经毒性的方式。

研究发现铝过负荷致神经元退变与脑内金属离子水平关系非常密切。铁是机体必需的一种重要微量元素，但是过量的铁可通过Fenton反应生成具有大量毒性极大的羟自由基，引发氧化应激反应，最终诱发神经元退行性变〔6〕。其他金属离子如铜、锌是脑内一些抗氧化性酶重要组成部分，如Cu-ZnSOD。何百成等〔7〕研究发现脑室给铝导致急性脑损伤，小鼠脑组织铁、铜、锌水平明显增加。罗映等〔8〕等研究发现铝过负荷可致小鼠脑组织Cu-ZnSOD活性先升高后下降，并认为铝过负荷引起脑氧化应激反应，抗氧化应激物质如Cu-ZnSOD表达增加，但是SOD基因长期受到自由基攻击而出现突变，造成抗氧化应激的酶功能下降，最终导致机体抗氧化应激系统失衡，加重损伤。

与上述研究结果相似，笔者的研究发现与空白对照组相比，模型组海马组织中金属离子铝、铁、铜、锌水平明显增加;给予美洛昔康在阻遏铝过负荷大鼠脑组织金属离子水平的增加。关于美洛昔康阻遏金属离子含量增加的机制，目前尚未完全揭示，有研究发现，前列腺素以及白三烯可促进血脑屏障的开放，从而加重脑缺血损伤〔9〕，通过笔者前期研究发现神经元退变能够明显诱导大鼠海马COX-2 mRNA和蛋白表达增加〔10〕，增加前列腺素的产生，从而开放血脑屏障，大量金属离子进入脑内，使得脑内金属离子含量明显增加;而美洛昔康作为COX-2选择性抑制剂，能够抑制COX-2 mRNA和蛋白表达，减少前列腺素的产生，重新关闭血脑屏障，因而使得进入脑内的金属离子含量明显降低。笔者的研究还发现，在脑内铁、铝离子含量明显高于其他金属离子，而以铁离子含量最高，这可能由于造模本身灌胃给予大量铝离子，使得大量铝离子在脑组织沉积，而铝通过影响铁调节蛋白2使细胞铁蛋白表达明显降低，最后致使铁水平显著升高〔11〕。

总之，美洛昔康对慢性铝过负荷致神经元退变大鼠脑内金属离子含量升高有明显的抑制作用。

1 Jalil EC，Falcon AG，Cabrera MG，et al.Assessment of the relative contribution of COX-1 and COX-2 isoforms to ischemia induced oxidative damage and neurodegeneration following transient global cerebral ischemia〔J〕.J Neurochem，2003;86(3):545-8.

2 Brenhouse HCS，Chen EY，Emerich DF，et al.Inhibitors of cyclooxygenase-2，but not cyclooxygenase-1 provide structural and functional protection against quinolinic acid-induced neurodegeneration〔J〕.J Pharmacol ExpTher，2003;306(1):218-21.

3 Fattoretti P，Bertoni-Freddari C，Balietti M，et al.The effect of chronic aluminum(III)administration on the nervous system of aged rats:Clues to understand its suggested role in Alzheimer disease〔J〕.J Alzheimer Dis，2002;5(6):437-40.

4 Carpenter DO.Effects of metals on the nervous system of humans and animals〔J〕.int J Occup Med Environ Health，2001;14(3):209-18.

5 Yang JQ，Zhao XH，Zhou QX，et al.Effects of nimodipine and fructose-1，6-diphosphate on cerebral damage in carbon monoxide poisoning mice〔J〕.Chinese Medical Journal，2003;116(12):1911-5.

6 Nappi AJ，Vass E.Iron，metal loenzymes and eytotoxic reactions〔J〕.Cell Mol Biol(Noisy-le-Grand)，2000;46(3):637-47.

7 何百成，滕永真，杨俊卿，等.铝过负荷致小鼠脑神经元退变与脑铁代谢失衡的关系〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，2006;20(1):66-70.

8 罗 映，何百成，徐蜀远，等.Cu-Zn SOD活力变化与铝致小鼠神经元退行性变关系.工业卫生与职业病，2007;33(6):349-53.

9 Stanimirovic D，Shapiro A，Wrong J，et al.The induction of ICAM-1 in human cerebromicrovascular endothelial ceils(HCEC)by ischemia-like conditions promotes enhanced neutrophil/HCEC adhesion〔J〕.J Neuroimmunol，1997;76(1-2):193-205.

10 苏 强，杨俊卿，张 鹏.美洛昔康对慢性铝超负荷致神经元退变大鼠海马环氧化酶2表达的影响〔J〕.中国药理与毒理学，2009;23(1):6-10.

11 Uz T，Pesold C，Longone P.Aging-associated up-regulation of neuronal 5-lipoxygenase expression:putative role in neuronal vulnerability〔J〕.FASEB J，1998;12(6):439-49.