白花丹参不同炮制品水提物抗小鼠心肌缺血缺氧的作用

王 浩 李玉琴 高永峰 辛晓明 徐晓燕 高允生 (泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

丹参是常用的活血化淤中药。白花丹参为唇形科植物丹参的白花变型，以根入药，是山东道地药材之一，属濒危珍稀药用植物。多年来，人们对紫花丹参研究较多，而对于白花丹参的研究仍处于起步阶段〔1〕。临床上丹参以生品和炮制品入药〔2〕。丹参炮制入药自唐代就有“熬令紫色”;宋代有炒炙、焙制;明清代有酒洗、酒浸、酒炒、酒蒸、猪血拌炒。目前丹参的炮制方法主要有酒炙、炒炭、麸炒、猪血制、醋制等〔3〕。随着炮制方法不同，其化学成分也发生了变化。生丹参主治温热病热入营血，所致心肌怔仲、失眠等症，如《温病条辨》清营汤。制丹参主要用于气滞血瘀、心胃诸痛等，如《时方歌括》丹参饮;胸憋闷、心绞痛，如《中国药典》(2005)复方丹参片〔4〕;气滞血瘀、胸闷、心悸气短，如《中国药典》(2005)冠心丹参片〔4〕。目前对于白花丹参是否具有抗心肌缺血作用，不同的炮制方法是否对这个作用存在影响还鲜见报道。因此，本研究采用不同的方法炮制白花丹参，并提取其中的水溶性成分，通过多种模型观察其对小鼠心肌缺血缺氧的影响。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 白花丹参原药由泰山医学院药学院药材栽培基地种植，于秋季取样，经药物分析教研室李玉琴博士鉴定。取原药去杂质及茎叶，取其根切片进行酒炙与炒炭。酒炙白花丹参:取丹参片，加入定量黄酒拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器用文火加热，炒干，取出晾凉，粉碎，过二十目筛;炒炭白花丹参:取丹参片，置炒制容器内，用武火加热，炒至表面焦黑色，内部焦褐色，取出晾凉，粉碎，过二十目筛。取酒炙白花丹参、炒炭白花丹参及生品白花丹参加入蒸馏水煎煮3次(W/V=1∶5)，每次武火煮沸后，文火微沸30 min，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩适当浓度备用。异丙肾上腺素购于上海禾丰制药有限公司。垂体后叶素注射液购于蚌埠市宏业生化制药厂;复方丹参片购于山东仙河药业有限公司;乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒购于南京建成生物工程研究所(批号:20100317)。

1.2 白花丹参生品、酒制品及炒炭品中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A的含量测定 根据文献〔5〕所述的方法，测定了白花丹参3种炮制品种4种水溶性成分的含量，测定结果见表1。

表1 白花丹参3种炮制品中四种水溶性成分的含量(s)

表1 白花丹参3种炮制品中四种水溶性成分的含量(s)

炮制品 丹参素(mg/g)原儿茶醛(mg/g)丹酚酸B(mg/g)丹酚酸A(mg/g)

1.3 实验仪器 小动物耐低氧与耗氧量动态变化同步测定装置〔6〕(泰山医学院药学院制备，专利号CN2698274);BL-410生物机能实验系统(成都泰盟生物科技有限公司);紫外分光光度计(上海棱光技术有限公司)。

1.4 实验动物 昆明种小鼠，雌雄各半，18～22 g，购于泰山医学院实验动物中心，合格证号:鲁动质字020103。

1.5 实验分组及方法

1.5.1 白花丹参不同炮制品水提物对异丙肾上腺素致心肌缺氧小鼠存活时间的影响 取小鼠随机分为9组，各10只，即空白组、模型组、复方丹参片组(3.6 g·kg-1·d-1)、生品白花丹参水提物高、低剂量组，酒炙白花丹参水提物高、低剂量组，炒炭白花丹参水提物高、低剂量组，剂量分别为30、20 g/kg。各给药组灌胃相应剂量药物，而空白组及模型组灌胃等容量蒸馏水，1次/d，连续5 d。末次给药1 h后，除空白组皮下注射等容量生理盐水外，余组皮下注射异丙肾上腺素20 mg/kg，15 min后将小鼠放入装有钠石灰的小动物耐低氧与耗氧量动态变化同步测定装置中，密闭装置，记录小鼠存活时间。

1.5.2 白花丹参不同炮制品水提物对夹闭气管小鼠心电维持时间的影响 取小鼠随机分为8组，各8只，即空白组，复方丹参片组(3.6 g/kg)、药物干预分组及给药剂量同上。除空白组灌胃等容量蒸馏水，余组给予相应剂量药物，1次/d，连续5 d。末次给药1 h后皮下注射乌拉坦(1.3 g/kg)麻醉、固定，BL-410生物机能实验系统描记小鼠标Ⅱ导联心电图，记录一段正常心电图后，动脉夹夹闭气管，记录小鼠心电维持时间(s)。

1.5.3 酒炙白花丹参水提物对垂体后叶素诱导小鼠心肌缺血的影响 小鼠于实验前进行筛选，剔除心电图(ECG)异常者。取ECG正常小鼠分为5组各10只，即对照组、模型组、酒炙白花丹参水提物高、低剂量组(30 g/kg、20 mg/kg)，复方丹参片组(3.6 g/kg)，空白组及模型组给予等容量蒸馏水，1次/d，连续2 w。末次给药1 h后皮下注射乌拉坦(1.3 g/kg)麻醉、固定，BL-410生物机能实验系统描记小鼠标准Ⅱ导联心电图，除空白组小鼠尾静脉注射等容量的生理盐水外，余组尾静脉注射垂体后叶素(30 U/kg)。连续记录给药后 10、30 s、1、2、5、10、20、30 min时ECG，以PR段为基线记录各组小鼠J点位移绝对值(mV)及心率的变化，每个时间点测3个连续的波型，取其平均值。给予垂体后叶素30 min后，各组小鼠摘眼球取血，按试剂盒说明测定血清LDH、CK的活性。取心脏制成组织匀浆，取上清液，参照试剂盒说明书测定心肌组织MDA、NO含量及SOD活力，考马斯亮蓝测定组织中蛋白含量。

2 结果

2.1 白花丹参不同炮制品水提物对异丙肾上腺素致缺氧小鼠存活时间及夹闭气管小鼠心电维持时间的影响 与空白组相比，模型组小鼠缺氧存活时间明显缩短(P＜0.01)。而生品低剂量组，酒炙高、低剂量组能明显延长小鼠缺氧存活时间(P＜0.05)，提高小鼠15 min和20 min的存活率，且生品低剂量组、酒炙高剂量组作用优于复方丹参片组。与空白组相比〔(367.13±59.24)s〕，生品高剂量组、酒炙低、高剂量组、炒炭低剂量组和复方丹参片组能明显延长夹闭气管小鼠心电维持时间 〔(759.17 ± 250.57)s，(651.29 ± 241.35)s，(672.43±105.90)s，(596.00±160.53)s，(717.50±263.75)s，P＜0.05〕，生品低剂量组、炒炭高剂量组小鼠心电维持时间无明显改变〔(553.4±99.28)s、(417.25±156.58)s，P＞0.05〕。见表 2。

表2 白花丹参不同炮制品水提物对异丙肾上腺素致缺氧小鼠存活率〔n(%)〕及存活时间(s)的影响

表2 白花丹参不同炮制品水提物对异丙肾上腺素致缺氧小鼠存活率〔n(%)〕及存活时间(s)的影响

与空白组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05

组别 n 15 min 20 min 存活时间(min)空白组 10 10(100.00)9(90.00)23.10±2.693)模型组 10 4(40.00)0(0.00)15.00±1.60生品低剂量组 9 6(66.67)3(33.33)19.50±1.391)生品高剂量组 8 5(62.50)0(0.00)17.00±1.41酒炙低剂量组 10 9(90.00)2(20.00)18.25±4.892)酒炙高剂量组 10 9(90.00)4(40.00)19.12±3.231)炒炭低剂量组 9 6(66.60)0(0.00)14.56±1.59炒炭高剂量组 8 6(75.00)1(12.50)17.25±5.63复方丹参片组 10 9(90.00)1(10.00)18.19±2.072)

2.2 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠心电图的影响 与空白组相比，模型组小鼠药后30 s心率明显减慢(P＜0.01)，10 min后恢复;而药后10 s即可引起J点明显上抬、位移绝对值提高(＞0.1 mV)(P＜0.01)，5 min 后恢复，说明垂体后叶素能引起心肌缺血。酒炙白花丹参水提物高、低剂量组及复方丹参片组均能显著对抗垂体后叶素所致的心率减慢及J点的改变(P＜0.05)。结果见表 3、表4。

表3 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠心率的影响(n=10，s)

表3 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠心率的影响(n=10，s)

与空白组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05;与模型组比较:3)P＜0.01，4)P＜0.05

组别 10 s 30 s 1 min 2 min 5 min 10 min 20 min 30 min空白组 523.57±70.81 517.00±64.58 535.00±63.13 536.50 ± 88.75 540.50±84.60 534.66±80.70 510.33±77.44 489.16±82.17模型组 466.71±91.66 277.00±155.471)323.38±81.231)364.50±100.831)409.50±118.702)491.00±154.87 530.13±125.23 562.63±35.97酒炙低剂量组 518.00±105.93 427.17±113.214)479.14±106.994)506.17±114.154)553.50±87.374) 520.83±78.32 505.14±63.58 515.00±62.93酒炙高剂量组 502.57±153.04 432.00±60.744)508.67±102.933)513.00±109.813)550.57±99.974) 531.71±85.65 520.32±92.62 516.83±107.35复方丹参片组 478.00±78.59 463.33±47.303) 490.17±78.544)496.50±108.874)507.33±91.174) 511.00±82.51 510.67±74.48 500.66±82.33

表4 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠心电图J点位移绝对值的影响(n=10，s)

表4 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠心电图J点位移绝对值的影响(n=10，s)

与空白组比较:1)P＜0.01，与模型组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05

组别 10 s 30 s 1 min 2 min 5 min 10 min 20 min 30 min空白组 0.020 8±0.010 4 0.023 3±0.007 6 0.030 8±0.006 2 0.024 5±0.011 7 0.048 5±0.017 7 0.023 8±0.009 7 0.061 5±0.020 8 0.063 3±0.017 9模型组 0.329 6±0.052 81)0.153 1±0.021 51)0.117 1±0.029 61)0.069 5±0.020 5 0.035 0±0.011 3 0.033 9±0.011 8 0.066 5±0.015 3 0.052 5±0.019 1酒炙低剂量组 0.290 5±0.034 7 0.114 8±0.034 3 0.076 7±0.020 63)0.047 5±0.034 0 0.045 2±0.014 0 0.017 4±0.007 1 0.066 8±0.012 3 0.051 2±0.026 5酒炙高剂量组 0.201 1±0.020 02)0.090 4±0.024 42)0.068 0±0.029 72)0.057 2±0.038 0 0.498 6±0.024 8 0.031 3±0.011 8 0.050 8±0.014 7 0.048 5±0.015 6复方丹参片组 0.231 1±0.033 93)0.103 5±0.020 43)0.078 7±0.021 23)0.055 0±0.015 9 0.056 3±0.014 8 0.043 1±0.017 6 0.044 8±0.020 2 0.054 8±0.033 0

2.3 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠血清生化指标的影响 与空白组相比，模型组小鼠血清LDH和CK活性显著升高(P＜0.01)。与模型组相比，酒炙白花丹参水提物高、低剂量组LDH 活性明显降低(P＜0.05、0.01)，仅高剂量组能明显降低CK 活性(P＜0.01)。见表5。

2.4 酒炙白花丹参对心肌缺血小鼠心肌组织生化指标的影响

与空白组相比，模型组小鼠心肌组织中MDA含量升高，SOD活力及 NO 含量均明显下降(P＜0.05、P＜0.01)。与模型组相比，酒炙白花丹参水提物高、低剂量组MDA水平显著降低，SOD活力及 NO 含量明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。见表6。

表5 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠血清LDH和CK活性的影响(s，n=10)

表5 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠血清LDH和CK活性的影响(s，n=10)

与空白组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05

组别 LDH(U/L)CK(U/ml)空白组 5 899.30±537.91 0.99±0.48模型组 8 933.98±1955.081) 3.20±0.851)酒炙低剂量组 7 356.06±1049.332) 2.58±0.83酒炙高剂量组 7 236.11±753.363) 1.85±0.582)复方丹参片组 6 602.81±729.712) 1.79±0.602)

表6 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠心肌组织中SOD活性和MDA、NO水平的影响(s，n=10)

表6 酒炙白花丹参水提物对心肌缺血小鼠心肌组织中SOD活性和MDA、NO水平的影响(s，n=10)

与空白组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05;与模型组比较:3)P＜0.01

组别MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)NO(μmol/mgprot)空白组 34.43±13.63 184.62±41.44 0.19±0.07模型组 61.67±15.991) 123.47±17.981) 0.10±0.012)酒炙低剂量组 45.43±14.512) 168.39±35.712) 0.21±0.103)酒炙高剂量组 35.02±6.543) 176.25±41.882) 0.13±0.01复方丹参片组 38.63±17.043) 189.65±40.423) 0.20±0.073)

3 讨论

缺氧是一种紧张性刺激，可引起机体产生各种应激性反应，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终导致机体的心脑等重要器官缺氧供能不足而死亡〔7，8〕。异丙肾上腺素皮下注射可造成心肌细胞缺血缺氧损伤，是一种常用的动物实验性心肌缺血模型。本研究结果显示，酒炙白花丹参水提物高、低剂量组均可明显延长小鼠耐缺氧存活时间，明显提高15、20 min小鼠的存活率，虽生品白花丹参水提物低剂量组也可延长小鼠存活时间，但对于小鼠存活率的影响不如酒炙白花丹参水提物明显。对于夹闭气管小鼠心电维持时间的影响，酒炙白花丹参水提物高、低剂量组均具有延长作用，生品高剂量组及炒炭低剂量组白花丹参水提物也可延长小鼠心电维持时间，但与酒炙白花丹参低剂量组无差异。综合以上，本课题组又进一步对酒炙白花丹参水提物的抗心肌缺血作用进行了研究。推测出现此结果的可能原因，与经不同的方法炮制后提取物的成分及含量不同有关。本课题组对3个炮制品水溶性分丹参素、丹酚酸B、丹酚酸A、原儿茶醛进行了检测，结果显示酒炙白花丹参水提物中包含丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B 3种成分，尤其丹酚酸B含量较高。丹酚酸B能够增加冠脉流量，还具有纤溶、保护血管内皮、抗氧化作用丹参素、原儿茶醛，是丹参中发挥抗心肌缺血作用的主要成分。有研究发现〔9〕，丹酚酸B的抗氧化作用明显强于丹参素及原儿茶醛。但对于进一步机制还有待研究。

垂体后叶素可引起冠状动脉痉挛，造成急性心肌供血不足，同时收缩全身小血管，增加外周阻力进而增加心脏后负荷，因此注射垂体后叶素可致动物发生急性心肌缺血，是常用的心肌缺血模型之一。ECG J点及心率是判断心肌缺血发生与否的一个重要指标〔10〕。本实验结果显示，尾静脉注射垂体后叶素后，J点位移增高、心率减慢，提示发生心肌缺血。而酒炙白花丹参低、高剂量对急性心肌缺血ECG J点及心率的改变有明显的改善作用，提示该药物对缺血心肌具有明确的保护作用，能够改善心肌供血供氧，维护心功能。缺血性心肌酶的释放量是心肌损害程度的主要标志，也是判断细胞从可逆到不可逆损伤的重要标志。心肌细胞的缺血缺氧使细胞膜的完整性受损，膜通透性增加，引起心肌酶释放增多，使血清中酶活力升高 ，造成心肌细胞代谢紊乱〔11〕。本实验结果表明，酒炙白花丹参可减轻细胞膜的损伤程度，减少心肌酶的释放，保护心肌细胞。NO是血管内皮细胞利用L-精氨酸在NOS作用下合成的具有扩张血管作用的内源性物质，被认为是内源性的心脏保护物质〔12〕。本实验观察到酒炙白花丹参水提物可显著抑制心肌缺血后NO含量的降低，提示其抗心肌缺血作用可能与NO有关。

总之，白花丹参不同炮制品水提物均有不同程度的耐缺氧作用，其中酒炙白花丹参水提物效果较好，进一步研究发现，酒炙白花丹参水提物具有明显的抗心肌缺血作用，可能与其具有抗氧化、影响NO有关。

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