东菱克栓酶对大鼠脑缺血再灌注损伤后基质金属蛋白酶-9表达的影响

孙 微 蒋维海 刘佳乐 韩 丽 (北华大学附属医院，吉林 吉林 3200)

东菱克栓酶(又叫巴曲酶，DF-521)是由巴西蝮蛇毒液中提取的单一成分酶制剂，可以选择性作用于血纤维蛋白原Aα键末端的精氨酸、甘氨酸之间，分解纤维蛋白原为纤维蛋白单体，后单体聚合成多聚体，后者被DF-521分解为纤维蛋白降解产物，同时，其具有分解凝血因子Ⅰ、抑制血栓形成、降低血黏度、增强红细胞变形能力、降低血管阻力等作用〔1～3〕。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组降解细胞外基质蛋白的锌依赖蛋白酶，有研究显示，脑缺血及再灌注后MMP表达增加，破坏血脑屏障;其中MMP-9与脑缺血再灌注损伤的关系尤为密切，在缺血早期血脑屏障损害中起着重要作用〔4～6〕。本研究探讨脑缺血再灌注损伤后应用DF-521的治疗作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料 东菱克栓酶注射液(巴曲酶)为北京托毕西药业有限公司，一抗为MMP-9兔多抗(武汉博士德生物工程公司)，链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶法(S-P)试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，合格证号:SCXK-(吉)2007-0003。清洁级动物室饲养，饮水不限，定时喂食。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及给药 实验动物按体重随机分为5组，每组8只，分别为假手术组、模型组、OF-521高、中、低剂量组(16、8、4 BU/kg)，按常规进行饲养，进行不同的处理，每天上午灌胃1次，持续3 d后，建立脑缺血动物模型。假手术组、模型组每日给予生理盐水灌胃(10 ml/kg)。

1.2.2 实验动物模型建立 采用栓线法制备脑缺血再灌注模型。雄性健康Wistar大鼠，末次给予药物2 h后10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)麻醉。用微动脉夹于右侧颈总动脉近心端夹住，用手术线于远心端打一活结，用栓线通过事先用眼科剪在颈总动脉上剪出的切口进入向颈内动脉缓缓推入约18 mm，感到有轻微阻力且标记点在动脉分叉处停止，此时说明栓线已达到大脑前动脉。用手术线结扎固定栓线，缝合皮肤。假手术组只分离出颈外动脉以及颈内动脉，其他步骤同上，但不进行栓塞〔3〕。待大鼠清醒后，观察大鼠的体征，出现以下体征者表明模型制作成功:右眼Honer＇s征;左前肢瘫痪，将鼠尾提起，大鼠不能充分伸展左前肢;当动物右旋时其左前肢拖在腹下，与右前肢交叉成剪刀状;当右旋时，其左前肢掌面向上，被拖在身体的左侧。48 h后立即断头取脑，观察脑梗死面积，同时进行病理组织学、免疫组化检测。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 大鼠脑梗死面积测定 实验结束后立即对大鼠进行取脑，于-20℃冰箱放置2 min，便于保持相对固定，便于对脑组织行冠状切片。将脑组织切成相对均匀的5片，避光于2%三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)37℃水浴中放置5～10 min，呈苍白色可判定脑缺血。可应用BI2000软件处理系统计算每个脑组织切片损伤面积和总面积，以5个脑组织切片中梗死面积之和与5个脑组织切片面积之和的百分比反映梗死范围。

1.2.3.2 苏木素-伊红(HE)染色 将提取标本进行常规石蜡包埋切片，厚5 μm，HE染色，观察缺血区细胞形态、大小、染色情况(×200)。

1.2.3.3 MMP-9免疫组化检测 实验模型成功后，进行心脏灌注固定，取视交叉前、后2 mm处的脑组织制作切片，脑组织取下后用石蜡包埋，制作厚约5 mm的连续脑切片。采用S-P染色法进行MMP-9免疫组织化学染色。细胞质着色呈棕黄色，经图像分析仪每个切片随机选择5个视野。采用Image-ProPlus 6.0软件检测每张图片积分光密度(IOD)值。

2 结果

2.1 各组脑梗死面积比较 与假手术组(0)相比，模型组的脑梗死面积(0.78±0.13)明显增大，说明大鼠脑缺血模型建立成功;与模型组比较，DF-521高、中剂量组的脑梗死面积(0.56±0.10、0.66±0.08)显著减小(P＜0.01，P＜0.05)，其中 DF-521 高剂量组较中剂量组效果更明显(P＜0.05)。DF-521低剂量组脑梗死面积(0.75±0.11)与模型组比较差异不显著。

2.2 HE染色结果 假手术组脑区细胞形态结构基本正常;模型组缺血区大部分细胞出现细胞核固缩、空泡样改变，大量淋巴细胞浸润;与模型组比较，DF-521高剂量组、中剂量组正常细胞较模型组明显增多，仅少数细胞出现核固缩样改变，且DF-521高剂量组改善更为明显。DF-521低剂量组改善不明显。提示DF-521对大鼠脑缺血再灌注病理学损伤具有保护作用。见图1。

图1 各组大鼠脑组织病理变化(HE，×200)

2.3 DF-521对 MMP-9的影响 与假手术组(2 013.5±103.65)比较，模型组 MMP-9表达的 IOD值明显增高(5 027.38±210.82)(P＜0.01);与模型组比较，DF-521 高、中剂量组 MMP-9表达的 IOD值明显降低(2 918.80±165.56，3 624.40±196.82)(P ＜ 0.05)，DF-521 低剂量组 (4 928.20±182.42)未见统计学差异(P＞0.05)。其中 DF-521 高剂量组、中剂量组及低剂量组MMP-9表达的IOD值两两比较具有统计性差异(P＜0.05)。

3 讨论

MMPs是一种Zn2+依赖性的蛋白水解酶，与缺血性脑卒中形成、发展和预后有很大关系。MMP-9是MMPs家族的核心成员，主要由血管壁的中性粒细胞和巨噬细胞合成和分泌，具有降解胶原蛋白和弹性蛋白的作用，从而破坏血管壁结构的完整性，并且破坏血脑屏障，导致渗漏和破裂，可引起血管壁基底膜破裂，促进斑块纤维帽基质降解，导致斑块不稳定，进而形成血栓，最终导致缺血性脑卒中的发生，甚至有些可能发生出血性转化〔7〕。在生理情况下，MMP-9以无活性的酶原形式存在，在脑缺血时由于炎症介质的作用，可能激活MMP-9，使其转换为活性成分，MMP-9通过降解Ⅳ、Ⅴ型胶原，破坏ECM和基底膜，破坏血脑屏障的完整性，引起并且加重脑水肿〔8，9〕。有研究表明，给予MMP抑制物可以改善脑缺血再灌注损伤，减轻血管源性脑水肿，减轻脑损伤。本实验研究结果显示，局灶性脑缺血再灌注大鼠给予DF-521后可明显减小梗死面积，并且随着剂量的增加，作用越明显。DF-521是强力降纤酶制剂，主要通过将纤维蛋白原转化为可溶性纤维蛋白原，降低纤维蛋白原的浓度，从而降低血液黏制度，改善血液情况，降低外周血管阻力，增加脑血流量，以达到改善脑组织的供血、抑制血栓形成的作用。通过本实验研究，认为DF-521降低MMP-9的表达可能是其作用机制之一。

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