高表达Klotho基因对糖尿病大鼠肾脏保护作用的机制

张晓暄 杨晓春 远 航 程海涛 王 晶 宝 玲 (一汽总医院肾内科，吉林 长春 300)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病微血管病变，一旦发展到终末期肾衰，往往比其他肾脏疾病治疗更加棘手〔1〕。Klotho基因是1997年发现的与衰老发生密切相关的功能性基因〔2〕，在人和大鼠的肾脏高表达，并主要定位于肾小管上皮细胞，在维持正常的肾脏生理功能方面发挥着重要作用。本课题组在前期研究中发现注射Klotho基因的糖尿病肾病模型大鼠，其肾脏病理改变有所好转，尿微量白蛋白减少，肾功能指标改善，表明Klotho基因对DN具有保护作用，但其机制尚不清楚。本研究拟探讨Klotho基因对DN肾脏保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 组织RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA marker，宝生物工程(大连)有限公司;免疫组化试剂盒、β-actin抗体，Abgent，美国;Klotho抗体、PAI-1抗体，北京博奥森生物技术有限公司;DMEM，Invitrogen，胎牛血清，Hyclon，美国;含Klotho基因的腺病毒，本课题组制备。

1.2 实验动物与分组 SPF级健康Wistar雄性大鼠72只，购自吉林大学动物中心，体重200～220 g。实验室适应性喂养1 w后，取18只大鼠为正常对照组(Con组)，其余54只大鼠禁食 12 h，按照 55 mg/kg体重腹腔注射 STZ〔3〕，72 h 后血糖值≥16.67 mmol/L为糖尿病，2 w后检测大鼠尿微量白蛋白增高证明DN大鼠模型建立成功。Con组腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。将54只DN大鼠随机分为DN组(腹腔注射STZ+静脉注射等体积生理盐水)、Ad组(腹腔注射STZ+静脉注射不含Klotho基因的腺病毒)、Klotho组(腹腔注射STZ+静脉注射含有Klotho基因的腺病毒)，Con组静脉注射等体积生理盐水。从糖尿病模型建立成功后第2周开始，Klotho组尾静脉注射3×108PFU腺病毒，Ad组尾静脉注射3×108PFU不含Klotho基因的腺病毒，每2 w注射1次〔4〕，DN组和Con组尾静脉注射等体积生理盐水。四组均于第4、8、16周处死大鼠。

1.3 免疫组化检测Klotho、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1蛋白在糖尿病大鼠肾脏的表达 取糖尿病大鼠肾脏，经4%多聚甲醛固定、切片，2%BSA封闭后，滴加1∶500稀释的抗大鼠Klotho、PAI-1抗体，DAB显色。镜下观察 Klotho、PAI-1蛋白在肾小球、肾小管及肾间质的表达。以β-actin蛋白作为对照。

1.4 RT-PCR检测基因mRNA在肾组织的表达情况 取大鼠肾，应用RNA提取试剂盒提取肾脏RNA，RT-PCR扩增Klotho、转化生长因子(TGF)-β1、p15、p21、p27、PAI-1、β-actin 基因，引物:Klotho 正义:5＇-TGGCTGAACCAAAAAAACAA-3＇，反义:5＇-GAGCGGTCACTAAGCGAATA-3＇，扩增片段 434 bp;TGFβ1 正义:5＇-ATGGTGGACCGCAACAAC-3＇， 反 义:5＇-GAGCACTGAAGCGAAAGC-3＇，扩 增 片 段 328 bp;p15 正 义:5＇-ATCCCAACGCCGTCAACC-3＇，反义:5＇-TGGCCCTGCTCTTCAGCT-3＇，扩增片段 259 bp;p21 正义:5＇-TACGTCTGGGAGCGTGTTC-3＇，反义:5＇-AAATCTGTTAGGCTGGTCTGC-3，扩增片段 266 bp;p27正义:5＇-AGCTTGCCCGAGTTCTACTA-3＇，反义:5＇-CAGGTCGCTTCCTCATCC-3＇，扩增片段 220 bp;PAI-1 正义:5＇-TACGACATCCTGGAACTGC-3＇，反义:5＇-CACCTCGATCTTGACCTTTT-3＇，扩增片段 324 bp;β-actin 正义:5＇-GGCCACCAACTTCGGAGTAA-3＇，反义:5＇-TGTTCCATGACCCCATGAGC-3＇，扩增片段 210 bp。

PCR 反应条件94℃ 30 s，55℃ ～62℃ 30 s，72℃ 20 s，35 个循环，72℃ 7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相，Quantity one图像分析软件进行灰度分析，以β-actin基因作为对照。

1.5 统计学分析 采用SPSS14.0统计软件，结果以s表示，两样本均数比较用t检验。

2 结果

2.1 免疫组化检测Klotho、PAI-1蛋白在糖尿病大鼠肾脏的表达与分布 与Con组相比，4、8、16 w时，DN组和Ad组大鼠肾小球、肾小管及肾间质内Klotho蛋白表达量减少，而Klotho组大鼠肾脏Klotho蛋白表达量变化不明显，与Con组接近(图1);与 Con组相比，DN组和 Ad组 PAI-1蛋白表达量增加，Klotho组的PAI-1蛋白表达量变化不明显，接近Con组(图2)。β-actin蛋白在不同时间各组的表达未见明显改变(图3)。

2.2 RT-PCR检测mRNA在肾组织的表达 琼脂糖凝胶电泳显示，Klotho、TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1 基因 PCR 产物与预期扩增产物大小一致。与Con组对比，在4、8、16 w时DN组和Ad组的Klotho mRNA表达量明显减少，Klotho组Klotho mRNA表达量变化不明显，但高于DN组和Ad组。DN组和Ad组TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1 mRNA 表达量明显高于 Con 组，Klotho组变化不明显，接近Con组，但低于DN组和Ad组。见图 4，图 5。

图1 糖尿病大鼠肾脏Klotho蛋白的表达与分布(×200)

图2 糖尿病大鼠肾脏PAI-1蛋白的表达与分布(×200)

图3 糖尿病大鼠肾脏β-actin的表达与分布(×200)

图4 琼脂糖凝胶电泳显示各扩增产物条带

图5 第 4、8、16 周糖尿病大鼠肾脏 Klotho、TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1基因mRNA的表达

3 讨论

ECM进行性积聚是DN的主要病理表现，也是DN进行性发展的重要因素，TGF-β1是DN发生、发展的重要中介，PAI-1是其引起ECM积聚的环节之一。TGF-β1可显著上调大鼠系膜细胞PAI-1 mRNA和蛋白质的表达并抑制纤溶酶活性〔5〕。DN肾脏PAI-1表达明显上升，PAI-1通过与组织型纤溶酶原激活物形成复合体而抑制其活性，抑制ECM的降解，对促进DN时ECM 积聚有至关重要的作用〔6～8〕。TGF-β1 既可以直接刺激ECM的合成，又可以通过促进PAI-1等蛋白酶抑制物的表达，促进 ECM 的积聚〔9〕。

Klotho基因是新近发现的独立的抗衰老基因，通过抑制TGFβ1的信号传导，可以抑制肾脏纤维化〔10〕。Takeshita等〔11〕研究表明Klotho基因表达下调可能通过上调PAI-1 mRNA的表达参与肾脏纤维化的发生。

肾素-血管紧张素系统(RAS)参与了DN发展的全过程，糖尿病时肾脏局部血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平增加导致血管收缩、肾小球内压力增高、肾小球系膜细胞及内皮细胞增生。活性增高的AngⅡ受体通过直接或间接诱导TGF-β1表达，刺激肾脏局部PAI-1的表达，促进肾小管间质成纤维细胞的增殖、分化。与本研究相似，有研究同样利用腺相关病毒作为载体，将转染Klotho基因到小鼠体内改善AngⅡ导致的肾脏损伤，转染组的肾功能改善、蛋白尿减少，肾小管、肾间质病理学改变减轻〔12〕。新近研究发现，在STZ诱导糖尿病小鼠动物模型中，抗衰老Klotho基因的缺失通过加强TGFβ1和mTOR信号表达，加速了早期DN的进展〔13〕。

本研究结果显示在DN大鼠模型的肾脏中，Klotho基因表达降低，TGF-β1、PAI-1的表达增高，经Klotho治疗后DN肾脏组织的Klotho基因表达增加，同时TGF-β1、PAI-1的表达显著下降，而无论DN未治疗组还是单纯腺病毒对照组均未见此种变化，提示Klotho基因可以下调TGF-β1的表达而减少 PAI-1的表达，缓解ECM积聚，延缓DN进展，从而保护DN大鼠肾脏功能。

DN早期肾脏肥大是其进展的始动因素之一，细胞周期调控蛋白是控制细胞生长的关键，与DN早期肾脏肥大密切相关〔14〕。p15、p21、p27是细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(CDKIs)家族的重要成员，是细胞周期的负调控因子，其中p15阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞的分裂增殖，p21基因可使细胞增殖所需的蛋白质磷酸化受阻，在细胞分化和凋亡中p21蛋白的表达增高，p27可阻止细胞通过G1/S期转化的限制点抑制细胞分裂增殖，使细胞周期停滞在G1期和S期的转换，使细胞有机会修复损坏的DNA或修复DNA复制过程中产生的错误〔15〕。

本研究表明Klotho基因通过下调细胞周期负调控蛋白p15、p21、p27的表达来保护DN大鼠肾脏功能。

综上所述，Klotho基因能够下调糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、PAI-1、p15、p21、p27基因的表达，对糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用，为临床上治疗糖尿病肾病提供新的干预治疗靶点和理论依据。

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11 Takeshita K，Yamamoto K，Ito M，et al.Increased expression of plasminogen activator inhibitor-1 with fibrin deposition in a murine model of aging“klotho”mouse〔J〕. SeminThrombHemost，2002;28(6):545-54.

12 Mitani H，Ishizaka N，Aizawa T，et al.In vivo klotho genetransfer ameliorates angiotensinⅡ-induced renal damage〔J〕.Hypertension，2002;39(4):838-43.

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