绞股蓝皂苷对2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织脂质沉积的影响

贺 琴 李德梅 李敬会 谭华炳 (湖北医药学院附属人民医院感染性疾病科，湖北 十堰 442000)

我国已成为仅次于印度的糖尿病第二大国，预计到2025年两国将各有2亿人口罹患糖尿病〔1〕，其中95%为2型糖尿病(T2DM)。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是脂肪肝(FLD)主要类型。NAFLD已成为发达国家和地区第一大肝病，在我国亦可能成为慢性肝病的首要病因〔2〕。T2DM患者NAFLD检出率为 50.45%〔3〕;NAFLD 导 致 T2DM〔4～6〕;说 明 T2DM 与NAFLD互为因果。绞股蓝及绞股蓝皂苷(GPS)能降低NAFLD兔肝脏脂质沉积量〔7〕，有治疗 T2DM、代谢综合征作用〔8，9〕。本研究通过高脂饲料饲养联合链脲佐菌素(STZ)注射建立T2DM并NAFLD模型，观察GPS对T2DM并NAFLD大鼠肝脏脂质沉积量影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及场地 65只SPF级雄性SD大鼠，体质量220～250 g，由湖北医药学院动物实验中心提供〔合格证号:No.scxk(湘)2009-0004〕。实验场地湖北省十堰市实验动物中心(湖北省实验动物设施使用证明号:00015644)。

1.2 实验饲料 普通饲料由湖北医药学院动物实验中心提供。胆固醇购自北京双旋生物培养基制品厂。猪油由市售板油自行炼制而成，蛋黄粉由市售鸡蛋自行制作。高糖高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按实验配方配制成成品使用(配方:78%普通饲料+2.5%胆固醇+8%蛋黄+7%猪油+4.5%蔗糖)。高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按照实验设计配方配制成成品使用(配方:82.5%普通饲料+2.5%胆固醇+8%蛋黄+7%猪油)。

1.3 材料及设备 甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血糖(GLU)检测试剂为瑞士Roche/Hitache公司原装进口试剂。STZ购于美国Sigma公司。GPS购自安康东科麦迪森天然药业有限公司，纯度为98%。全自动生化检测仪(瑞士产，Roche/Hitache7600)。冷冻低温离心机(上海中科生物医学高科技开发有限公司，DL-45R-L)。Olympus DP-70显微摄影系统(日本，奥林巴斯公司)。德国产组织匀浆机。

1.4 实验模型的建立

1.4.1 实验动物的分组 SD大鼠购入后，普通饲料饲养观察1 w，动物无死亡及不良反应。按照实验设计将65只大鼠分为空白对照组(7只，N组)，NAFLD模型组(NM组，7只)，T2DM并NAFLD模型组(51只)。

1.4.2 T2DM并NAFLD造模与干预 参照文献〔10〕，每鼠每天高糖高脂饲料20 g左右，分两次投入，喂养4 w;大鼠隔夜空腹腹腔注射 STZ 40mg/kg，48h后尾静脉取血，GLU＞11.1 mmol/L，纳入实验组，造模成功率为100%;继续给予高糖高脂饲料喂养至8 w，期间大鼠死亡15只。将全部大鼠分为GPS大剂量组(9只，JH组)，给予GPS 1 g·kg-1·d-1灌胃;GPS小剂量组(9只，JL组)，给予 GPS 0.5 g·kg-1·d-1灌胃;T2DM并NAFLD模型对照组(9只，M组)同等体积的纯净水灌胃;继续给予高糖高脂饲料，自由饮水;治疗周期为6 w;实验周期14 w。

1.4.3 N组、NM组饲养与管理 N组每天给予普通饲料20 g左右(根据NAFLD组进食量调整);NM组给予高脂饲料20 g左右(依据前1 d进食量决定第2天进食量);饲料分2次投入。自由饮水。实验周期14 w。

1.5 标本的采集与检测

1.5.1 血液标本的采集与处理 试验结束时，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露腹主动脉，腹主动脉采集血液10 ml于肝素管，离心取血清，保存于-20℃的冰柜中待检。

1.5.2 血清TG、TC、BLU，肝组织TG检测 同步按仪器和试剂说明书要求，检测血清TG、TC、GLU，肝组织TG。

1.5.3 肝组织匀浆的制备 在肝脏最大叶边缘0.5 cm处取小块肝组织一块，冰生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取0.5 g置于预冷的5 ml生理盐水，迅速用内切式匀浆机4 000 r/min匀浆10 s/次，间隙30 s，连续3次，碎冰块中制成10% 的肝匀浆，高速冷冻离心机4℃、3 000 r/min离心10 min，取上清3 ml密封，-20℃冷存待检。

1.5.4 肝脏病理学检测 在肝脏最大叶，取肝组织0.5 cm，常规固定、切片、HE染色，检测肝脏病理学变化。

1.6 统计学处理 所有数据采用SPSS 9.0统计学软件处理，数据以s表示，治疗前后组内及组间比较用t检验。

2 结果

2.1 实验过程中大鼠数量变化 模型组在T2DM并NAFLD造模过程中，死亡大鼠15只，死亡率为29.41%;实验过程中，JH组、JL组、M组分别有1、2、3只大鼠死亡，实验结束JH组有8只，JL组有7只，M组有6只。NM组有6只。N组实验过程中无死亡。实验开始有65只，实验结束时有41只。

2.2 GLU变化 见表1。NM组与JH组、JL组、M组差异显著(P＜0.01);NM 组与 N 组存在显著差异(P＜0.01)。

表1 模型组、干预组与对照组TG、TC、肝组织TG(s)

表1 模型组、干预组与对照组TG、TC、肝组织TG(s)

与 NM 组比较:1)P＜0.01;与 N 组比较:2)P＜0.01;与 M 组比较:3)P＜0.05

组别 n GLU(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)肝组织TG(mg/g)JH 组 8 13.12±1.081)2.64±0.482)3)6.88±1.112)3)142.87±6.642)JL 组 7 15.55±1.151)3.21±0.592)3)8.26±0.892)3)164.92±7.562)M 组 6 21.68±1.241)4.98±0.592)10.12±1.262)214.46±5.442)NM 组 6 7.92±0.72 3.56±0.412)7.98±1.022)198.46±6.982)N 组 7 4.98±0.441) 0.85±0.19 2.12±0.15 28.98±1.68

2.3 TG、TC变化 与N组比较，NM组、JH组、JL组、M组TG、TC 上升(P＜0.01)，JH 组、JL 组低于 M 组(P＜0.01)。见表1。

2.4 肝组织TG浓度 与N组比较，NM组、JH组、JL组、M组肝组织TG上升(P＜0.01)。见表1。

2.5 肝脏病理学 N组为正常肝脏，NM组为重度FLD，MFLD程度最严重;JL与NM组程度相似;JH组FLD程度最轻。见图1。

图1 各组肝脏病理学改变(HE，×400)

3 讨论

NAFLD与T2DM互为因果，已经得到公认。本实验NAFLD模型对照大鼠存在GLU升高也说明这一点。T2DM与NAFLD在发病机制上存在“共同土壤”胰岛素抵抗(IR)而成为其重要病因〔10〕。在糖尿病患者中，血浆游离脂肪酸(FFA)水平升高，TG增高，HDL水平降低，引起脂代谢紊乱，大量脂肪进入肝细胞，在肝内蓄积，形成脂肪沉着及肝细胞变性、肿大形成脂肪肝〔11〕。肝脏内的脂肪沉积又导致 IR，形成恶性循环，加重糖、脂代谢紊乱，促进FLD形成〔12〕。改善糖代谢紊乱、调节血脂代谢、减少TG在肝脏的沉积，对治疗T2DM并NAFLD具有重要意义。

中医认为T2DM合并NAFLD是由于湿热内蕴、痰瘀互结;西医“共同土壤学说”提出高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗、T2DM与慢性全身性低度炎症状态及氧化应激有关。炎症因子C反应蛋白(CRP)在肝脏合成，FLD与CRP异常有关〔6〕。现代药理研究证明绞股蓝含有83种与人参皂苷有类似骨架的达玛烷型GPS，皂苷具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫调节等多方面的生物活性和药理作用〔13〕，Norberg等〔14〕从绞股蓝中分离提纯出一种新的皂苷，存在4种可以相互转化的立体异构体，在体外及动物实验中均发现，其可刺激胰岛细胞释放胰岛素，且呈现剂量依赖性。Xu等〔15〕对绞股蓝中分离得到的皂苷及其衍生物的降糖作用进行了研究，发现其可以通过抑制蛋白酪氨酸磷脂酶来控制胰岛素的敏感度，结合绞股蓝对CRP升高有抑制作用、能降低兔肝脏脂质沉积量，说明绞股蓝及GPS具有多靶点干预T2DM并NAFLD作用。

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13 李勇杰，苏宏业，李圣琦.2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝检出率及临床特点〔J〕.广西医学杂志，2012;34(1):868.

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