胶原和钙结合EGF域1的表达与直肠癌组织淋巴管生成及预后的关系

李文媛 王 莹 刘艳翠 尹国华 冯克俭 (牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江 570)

癌细胞经淋巴道转移是直肠癌最重要的转移方式和影响预后的最主要因素之一〔1〕，因而研究直肠癌淋巴管生成和转移机制具有重要的临床价值。胶原和钙结合EGF域1(Ccbe1)是Hogan等〔2，3〕报道的一种新发现的淋巴管生成因子，在人类和斑马鱼的淋巴管发育和生成过程中发挥重要作用，并具有调节细胞外基质重塑及迁移的功能〔4〕，其表达上调能够促进肿瘤细胞迁移和存活。迄今为止，Ccbe1参与调控淋巴管生成的具体机制尚未清楚。本研究探讨直肠癌中Ccbe1的表达及其与淋巴管密度、淋巴结转移和直肠癌预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取牡丹江市肿瘤医院2007年12月至2010年5月原发直肠癌患者45例。女17例，男28例，年龄≥60岁26例;＜60岁19例。按世界卫生组织(WHO)病理分型标准:高分化27例，中分化15例，低分化3例。Dukes A期5例、B期7例、C期21例、D期12例。淋巴结转移16例。对照组20例，均为直肠息肉手术切除病例。随访至2011年6月20日，随访时间为4～60个月，平均36个月。

1.2 主要试剂 Ccbe1抗体和LYVE-1抗体购自美国Sigma公司，免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Trizol试剂、SuperscriptⅡ反转录酶、dNTPs购自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA标志物购自Takara公司，Ccbe1和β-actin引物由大连宝生物合成。

1.3 免疫组织化学染色 严格按照免疫组化试剂盒说明的步骤进行，其中一抗浓度Ccbe1(1∶100)、LYVE-1(1∶200)。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。评分标准按照细胞着色强度(无0分;弱1分;中2分;强3分)和切片中阳性细胞率评分(≤5%，0分;6% ～0%，1分;11% ～20%，2分;21% ～50%，3分;＞50%，4分)之和为该病例评分值，将评分值≤2分为阴性，≥3分为阳性。LVD定量分析:先在低倍镜下选择淋巴管最丰富区域，在高倍镜下计数5个视野淋巴管数，取其均值作为该切片淋巴管数。

1.4 实时荧光定量PCR检测 总RNA提取，采用Zacharek等〔5〕报道方法进行PCR反转录、检测及荧光定量分析。引物设计及合成按照已报道的序列设计并合成Ccbe1以及内参照β肌动蛋白β-actin的特异性引物。各引物的序列为:Ccbe1:上游5’-CTTGGGAAGGCAAGACTCAC-3’，下游5’-AGCCCCTGAT-GAAGGAGTTT-3’;β-actin:上游 5-TGAAGGTCGGTGTCAACGGA-3，下游5-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3。分析方法采用2-△△CT方法。

1.5 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件进行χ2检验、t检验、LSD法和Kaplan-Meier生存分析。

2 结果

2.1 Ccbe1的表达情况 Ccbe1阳性表达位于细胞质和细胞膜内，呈棕黄色颗粒状，阴性细胞胞质和胞膜不着色。Ccbe1在直肠癌组织中的阳性表达率为68.8%，明显高于直肠息肉组中阳性表达率(25.0%)(χ2=10.794，P ＜0.01)。

2.2 Ccbe1表达与临床病理特征的关系 在各种临床因素中，Ccbe1蛋白表达与Ducks分期、淋巴结转移密切相关(P＜0.01)，而与年龄、性别及肿瘤分化程度各组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 Ccbe1在直肠癌组织中的阳性表达(n)

2.3 Ccbe1表达与LVD的关系 LYVE-1特异性地表达在直肠癌组织中淋巴管内皮细胞，呈棕色管腔。Ccbe1阳性组LVD(14.65±0.84)显著高于阴性组(10.10±0.52)(t=9.145，P＜0.01)。

2.4 实时荧光定量PCR的扩增效率检测 直肠癌组织中淋巴结转移组(0.104±0.011)和无淋巴结转移组(0.067±0.006)Ccbe1 mRNA的相对表达较声带息肉组(0.041±0.002)明显增加(P=0.000)，有淋巴结转移组中Ccbe1 mRNA表达显著高于无淋巴结转移组(F=68.286，P＜0.01)。

2.5 生存率分析 Ccbe1阳性组平均生存时间〔(44.41±5.61)个月〕，明显低于阴性组〔(61.70±4.81)个月〕，Log rank检验表明Ccbe1阳性表达与生存曲线负相关(χ2=4.059，P＜0.05)。

3 讨论

约40%的直肠癌病例确诊时已发生远处转移，而淋巴管转移是直肠癌主要转移方式〔1〕。最近发现的癌基因Ccbe1一种分子量为44 kD的蛋白，这种蛋白包含许多可供识别的结构单位，包括可结合一个天冬氨酸/天冬酰胺羟基化位置的EGF样区域，此区域具有细胞活力相关蛋白的重要特征〔2〕。目前关于Ccbe1对肿瘤的作用尚不明确，有研究〔4，6〕发现 Ccbe1基因具有调节细胞外基质重塑及迁移的功能，其表达上调能够促进肿瘤细胞迁移和存活。但有研究〔7〕发现Ccbe1在卵巢癌细胞株和卵巢原发癌中显著下调，并与卵巢癌的肿瘤分化、肿瘤分级和低存活率负相关。本研究推测Ccbe1能够促进直肠癌的发生和转移。本研究还提示检测直肠癌患者Ccbe1的表达将有望成为判断直肠癌预后的新指标。

Hogan等〔2〕发现Ccbe1是淋巴管萌芽和淋巴管静脉内皮细胞从主静脉迁移的关键因素，沉默Ccbe1基因可致淋巴管不能从原始的静脉发芽并形成脊索旁淋巴前体，导致斑马鱼淋巴管发育受阻并引起水肿，而Alders等〔3〕对人类 Hennekam淋巴管扩张症研究也证实了这一结果。在本试验中直肠癌组织中Ccbe1表达与淋巴管密度密切相关，证实了Ccbe1能够促进直肠癌淋巴管生成，我们推测其机制可能与Ccbe1能够显著地增强血管内皮生长因子-C表达，进而促进淋巴管生成表达有关〔8〕，但其具体作用机制仍需进一步研究和证实。

综上，Ccbe1能够促进直肠癌淋巴管生成和淋巴管转移，Ccbe1的检测将有望成为判断直肠癌患者预后的一个新指标。

1 黄景山.老年直肠癌患者188例预后因素分析〔J〕.中国老年学杂志，2011;9(31):3260-2.

2 Hogan BM，Bos L，Bussmann J，et al.Ccbe1 is required for embryonic lymphangiogenesis and venous sprouting〔J〕.Nature Genet，2009;41(4):396-8.

3 Alders M，Hogan BM，Gjini E，et al.Mutations in CCBE1 cause generalized lymph vessel dysplasia in humans〔J〕.Nature Genet，2009;41(12):1272-4.

4 Barton CA，Gloss BS，Qu W，et al.Collagen and calcium-binding EGF domains 1 are frequently inactivated in ovarian cancer by aberrant promoter hypermethylation and modulates cell migration and survival〔J〕.Br J Cancer，2010;102(1):87-96.

5 Zacharek A，Chen J，Cui X，et al.Angiopoietin1/Tie2 and VEGF/Flk1 induced by MSC treatment amplifies angiogenesis and vascular stabilization after stroke〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2007;27(3):1684-91.

6 王 莹，李文媛，张大伟，等.Ccbe1在喉癌中的表达及其临床意义.山西医科大学学报，2012;43(1):58-61.

7 Hauptmann S，Denkert C，Koch I，et al.Genetic alterations in epithelial ovarian tumors analyzed by comparative genomic hybridization〔J〕.Hum Pathol，2002;33(6):632-41.

8 Bos FL，Caunt M，Peterson J，et al.CCBE1 is essential for mammalian lymphatic vascular development and enhances the lymphangiogenic effect of vascular endothelial growth factor-C in vivo〔J〕.Circ Res，2011;109(5):486-91.