RP-HPLC法测定利脑心胶囊中丹参素的含量

胡 辉，彭 燕，张 倩（解放军474医院药剂科，新疆 乌鲁木齐 830013）

利脑心胶囊是由丹参、赤芍、粉葛、川芎等15味中药材经现代工艺加工而成。具有活血化瘀、行气化痰、通络止痛之功效，临床上主要用于冠心病、心肌梗死、脑动脉硬化[1]等疾病的治疗。丹参是本制剂的君药，其主要有效成分有丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛等。丹参素具有显著的改善血液流变学、降脂质、抑制脂质过氧化、抗肿瘤和脏器损伤保护等药理活性[2]，对于治疗心脑血管类疾病有着重要意义。中药制剂成分复杂，其主要疗效不是某单一成分，而是有效部位群，目前，利脑心胶囊是以丹酚酸B作为定量检测指标，而对制剂中丹参素的含量测定方法尚未见报道。本文建立RP-HPLC法测定制剂中丹参素的含量，以期为进一步完善该制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津国际贸易有限公司）；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）；CQ-250型超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）。

丹参素钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号110855-201210）；利脑心胶囊（吉林敖东延边药业股份有限公司，批号1111007、1109001、1208003、1207001）；甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-1%冰醋酸（10∶90）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量： 10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取丹参素钠对照品约5.80 mg，精密称定，置于5 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含1.16 mg（相当于丹参素1.058 mg）的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取利脑心胶囊10粒，将其内容物混合均匀后，取内容物细粉约2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz）50 min，冷却至室温，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，放置片刻，离心，精密吸取上清液25 mL，将溶剂挥干，加水约15 mL，完全溶解后将溶液转移至分液漏斗中，用稀盐酸调pH值至2，加氯化钠1.5 g，摇匀使溶解后，用乙酸乙酯萃取4次，每次30 mL，合并萃取液，浓缩至干，残渣中加少量50%甲醇使溶解，并转溶至25 mL的量瓶中，定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 按照利脑心胶囊的处方及制备工艺，制备不含丹参的阴性对照样品，再按供试品溶液的方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性实验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果显示，阴性样品对样品测定无干扰。理论塔板数按丹参素峰计算不低于3000，色谱图见图1。

图1 利脑心胶囊中丹参素的HPLC色谱图A – 对照品，B – 供试品，C – 阴性对照；1 – 丹参素Fig 1 HPLC chromatograms of tanshinol in Linaoxin capsule A – reference substance, B – sample, C – negative reference substance;1 – tanshinol

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下的丹参素对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以丹参素浓度（X）对峰面积值（Y）进行线性回归，得回归方程为：Y = 7 546.57X – 15 352.60（r = 0.999 7，n = 6）。结果表明，丹参素在10.58 ～ 105.80 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取同一浓度为21.16 μg·mL-1的丹参素对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积值。结果显示，RSD为0.17%（n = 6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取利脑心胶囊内容物（批号1111007），按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，在“2.1”项下色谱条件下进行测定，丹参素含量的平均值为27.26 μg·mL-1，RSD为 1.54%（n = 6），表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取利脑心胶囊内容物（批号1111007），按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，室温静置，按“2.1”项下色谱条件检测，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积值，RSD为0.19%（n = 6）。结果表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。

2.8 加样回收率实验

取已知含量的利脑心胶囊（批号1111007，含丹参素0.272 0 mg·g-1）内容物适量，研细，取6份，每份约1.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入丹参素对照品溶液（0.350 1 mg·mL-1）1 mL及50%甲醇49 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率。结果平均回收率为99.51%，RSD为1.60%（n = 6）。详见表1。

表1 丹参素回收率实验测定结果. n = 9Tab 1 Results of recovery test for tanshinol. n = 9

2.9 样品含量测定

取4批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，采用外标法计算丹参素的含量，平均值为0.360 8 mg·g-1详见表2。

表2 样品含量测定结果Tab 2 Results of content determination of samples

3 讨论

目前丹参素的含量测定方法主要有纸层析比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法、紫外分光光度法、荧光分光光度法[3-4]等。因本品含有15味中药材，成分复杂，故采用RP-HPLC法测定制剂中丹参素的含量，本方法具有分离效能高、灵敏、准确，方法简便、重现性好等特点。

3.1 检测波长的选择

取对照品溶液，在200 ～ 400 nm范围内扫描，丹参素最大吸收波长在280 nm处，故选择280 nm作为检测波长。

3.2 供试品溶液制备方法的考察

本文分别考察了提取溶媒（水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇），超声处理时间（20、30、40、50 min）及乙酸乙酯萃取次数（3次、4次、5次）。结果表明，用50%甲醇为提取溶媒，超声处理50 min，乙酸乙酯萃取4次时，丹参素的提取含量最高。

3.3 流动相的选择

分别考察了乙腈-1.2%冰醋酸、甲醇-水-磷酸、甲醇-1%冰醋酸系统等洗脱体系[5-10]，比较分离效果，结果显示，以甲醇-1%冰醋酸（10∶90）为流动相，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃的条件下，丹参素色谱峰形及分离度均较好。