肾移植患者吗替麦考酚酯血药浓度监测

彭明丽，赵冠人，申 健（解放军309医院药剂科，北京 100091）

吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）是麦考酚酸（mycophenolic acid，MPA）的2-乙基酯类衍生物，MPA通过非竞争性抑制嘌呤合成途径中次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的活性，抑制T、B淋巴细胞的增殖反应，发挥免疫抑制作用，具有高效、高选择性、非竞争性、可逆性的药理学特质，临床上主要用于肝、肾、心脏及骨髓移植中排斥反应的预防和治疗[1]。

MPA的免疫抑制效果明显，但药物过量时其药品不良反应（adverse drug reaction，ADR）同样不可忽视。麦考酚酸的蛋白结合率为97% ～ 99%，药动学个体差异大，且药动学与其免疫抑制效果及ADR的发生有密切的关系[2]。MMF的有效治疗窗比原有概念中的治疗窗窄，且急性排斥反应与毒副反应的发生率与血药浓度相关性大[3]，因此，开展MMF治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）有一定的临床意义。使用TDM指导MMF临床用药，其目标是通过TDM使器官移植患者在使用MMF时达到最佳治疗效果且ADR发生率降至最低，从而使MMF的临床用药真正做到个体化，为器官移植患者带来更大的益处。

为了进一步探讨对MMF进行TDM的临床意义，我们选取了83例服用MMF的本院肾移植患者，对其血药浓度进行测定，并对数据进行分析。

1 材料

1.1 资料来源

选取2012年10 – 12月在我院住院或门诊定期监测血浆MPA的肾移植患者，共83例。其中，服药前血药浓度（C0）46例，服药后2 h血药浓度（C2）37例。在C0测定的免疫抑制用药方案中，与环孢素（CsA）联用的C0共37例，与他克莫司（FK506）联用的C0共9例。男性52例，女性31例，年龄16 ～ 61岁，平均年龄（42.2±26.2）岁，平均体质量（56.6±12.2） kg。

1.2 仪器与试药

岛津HPLC液相系统，包括LC-10ATvp双泵、SPD-M20A二级管阵列检测器、CTO-10Avp柱温箱、SIL-10ADvp自动进样器、SCL-10Avp系统控制器、DGU-10A脱气装置、LC-Solution色谱工作站（日本岛津公司）；5417R台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；XW-80A漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）。

MPA对照品（Sigma公司，含量：98%，批号019k4106）；萘啶酸对照品（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，含量：99.5%，批号00621）；乙腈为色谱纯（Dikma公司）；三氟乙酸为色谱纯（Dikma公司）；水为Millipore制备超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm。

2 方法

2.1 免疫抑制用药方案

对肾移植术后的患者采用CsA+MMF+泼尼松（Pred）或FK506+MMF+Pred三联免疫抑制方案。MMF于手术当日开始口服，起始剂量为1.5 g·d-1；肾移植术后FK506起始剂量为0.15 mg·kg-1·d-1；CsA起始剂量为60.15 mg·kg-1·d-1；手术当日起静注Pred（0.5 g，qd），至术后第3天改为口服Pred，起始剂量为40 mg·d-1，逐渐减量。

2.2 血样采集

采血时间为晨起给药前及给药后2 h，取静脉血2 mL，置EDTA-Na真空抗凝管中，当日测定血浆中MPA浓度。

2.3 血药浓度测定方法

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（40∶60）；检测波长：215 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样体积：20 μL。

2.3.2 MPA标准溶液与内标萘啶酸溶液的配制 精密称取MPA对照品12.49 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为499.60 μg·mL-1的MPA标准溶液；精密称取萘啶酸对照品6.01 mg，置于50 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为120.20 μg·mL-1的内标萘啶酸溶液，以上溶液置于6 ℃冰箱储存。

2.3.3 血浆样品处理 取血浆样品200 μL于1.5 mL离心管，加入内标20 μL，乙腈600 μL，旋涡混合，14 000 r·min-1离心15 min，取上清液20 μL，进样。

2.3.4 专属性实验 本实验条件下，麦考酚酸及内标萘啶酸有对称的色谱峰和良好的分离度，血浆中杂质峰及合用的其他药品峰不干扰样品的测定，本方法具有较高的专属性，见图1。

图1 麦考酚酸和萘啶酸色谱图A – 对照品，B – 空白血浆，C – 血浆样品，D – 合用环孢素患者血浆样品，E – 合用FK506患者血浆样品；1 – 麦考酚酸，2 – 萘啶酸Fig 1 Chromatograms of MPA and nalidixic acidA – standard, B – blank plasma, C – MPA and nalidixic acid standard added in blank plasma, D – plasma of patient taking CsA, E – plasma of patient taking FK506; 1 – mycophenolic acid, 2 – nalidixic acid

2.3.5 标准曲线与线性范围 取人空白血浆180 μL，分别加入MPA标准溶液适量，精密配制成质量浓度分别为0.20、0.50、1.00、5.00、9.99、19.98、49.96 μg·mL-1的血浆样品，按“2.3.3”项下方法处理，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。以样品与内标峰面积比值（Y）对浓度（C）进行回归计算，结果表明MPA在0.20 ～ 49.96 μg·mL-1范围内线性良好，得回归方程为：Y = 0.665 76C – 0.012 057，r = 0.999 6。在上述条件下测得血浆中MPA最低检测浓度为0.20 μg·mL-1。2.3.6 精密度和准确度实验 分别于180 μL的空白血浆中加入低、中、高3种浓度（0.50、5.00、19.98 μg·mL-1）的麦考酚酸对照品溶液20 μL，混匀，得低、中、高3种不同浓度麦考酚酸的血浆样品，按“2.3.3”项下方法处理，按“2.3.1”项下色谱条件进样，依法测定日内与日间（3 d内）精密度，结果见表1。分析可知，日内RSD均小于10%，日间RSD均小于15%，符合规定。

表1 麦考酚酸的相对回收率和精密度Tab 1 Relative recovery and precision of MPA

2.3.7 麦考酚酸稳定性考察 取已知麦考酚酸浓度血浆样品数份，分别置室温条件下存放0、1、2、4、8、16、24 h后，按血浆样品的处理与测定方法操作，测定麦考酚酸浓度，考察样品放置稳定性。结果血浆样品在室温放置24 h稳定，RSD均小于15%，同时考察了样品在– 20 ℃冰箱中存放一个星期的稳定性，测得结果表明样品稳定，RSD均小于15%，符合规定。

2.3.8 回收率实验 分别于180 μL的空白血浆中加入低、中、高3种浓度（0.50、5.00、19.98 μg·mL-1）的麦考酚酸对照品溶液20 μL，混匀，得低、中、高3种不同麦考酚酸浓度的血浆样品，按血浆样品的处理及测定方法操作，结果麦考酚酸平均回收率均大于90%，RSD均小于3%，见表2。

表2 麦考酚酸的提取回收率Tab 2 The extraction recovery of MPA

2.3.9 样品测定 取46名患者给药前血浆（C0）及37名患者给药后2 h血浆（C2），按“2.3.3”项下血浆样品处理方法操作，取上清液20 μL按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，另取含麦考酚酸低、中、高浓度（0.50、5.00、19.98 μg·mL-1）的血浆样品各3份，作为质控随行测定，RSD均小于3%。根据内标法加校正因子法计算MPA浓度。

2.4 统计学方法

不同免疫抑制方案MPA谷浓度（C0）数据的比较采用t检验。

3 结果

3.1 MPA谷浓度（C0）测定结果的分布

血浆MPA谷浓度范围为0.34 ～ 3.99 μg·mL-1，测定值的分布情况见表3。谷浓度与抗排斥效果相关较大，由表3可见，按治疗窗1.0 ～ 3.5 μg·mL-1计算[4]，有效率为47.83%。

表3 血浆MPA C0测定值的分布Tab 3 Range distribution of C0 about MPA in plasma

3.2 不同免疫抑制方案中MPA谷浓度（C0）的测定结果

与CsA联用方案中，MPA谷浓度范围为0.17 ～3.05 μg·mL-1，谷浓度平均值为（1.26±0.78）μg·mL-1；与FK506联用方案中，MPA谷浓度范围为0.03 ～ 3.99 μg·mL-1，谷浓度平均值为（1.43±1.22）μg·mL-1，二者具有显著性差异（P ＜ 0.05）。

3.3 MPA峰浓度（C2）测定结果的分布

血浆MPA峰浓度范围为0.91 ～ 12.78 μg·mL-1，测定值的分布见表4。MPA峰浓度与不良反应的发生相关性较大，由表4可见，将浓度范围未达到2.00 μg·mL-1计为无效果[4]，则无效率为21.62%；将浓度范围高于10.00 μg·mL-1计为中毒[4]，则中毒率为8.11%。

表4 血浆MPA C2测定值的分布Tab 4 Range distribution of C2 about MPA in plasma

4 讨论

MMF是预防和治疗异体肝、肾和心脏移植后器官排斥反应的免疫抑制药物，口服后可迅速经肠道吸收，脱酯化后转化为有活性的MPA从而发挥免疫抑制作用。由于MPA的治疗窗窄，药动学过程个体差异大，因此对其开展TDM有重要的临床意义。MPA药动-药效相关性表明，0 ～ 12 h内曲线下面积（AUC0-12）是预测急性排异相关性最好的指标，但传统的AUC0-12方法采血点多，患者依从性差，检测成本高，临床上难以实施。报道[5]指出，MPA谷浓度C0与急性排斥反应相关性较大，峰浓度与毒副反应相关性较大，因此本文依据此二者作为MMF效应评价指标。

有关血浆中MPA浓度的检测，研究报道有酶联免疫法[6]、液质联用法[7]、高效液相色谱-荧光检测法[8]等，这些方法往往具有特异性不强、成本高、处理方法复杂等特点，难以普及应用。我们建立了一种简便、快速测定移植患者血浆中MPA浓度的高效液相色谱法，可用于常规血药浓度的监测。

本文测定结果显示，与CsA联用时MPA谷浓度范围为 0.17 ～ 3.05 μg·mL-1，谷浓度平均值为（1.26±0.78） μg·mL-1；与FK506联用时MPA谷浓度范围为0.03 ～ 3.99 μg·mL-1，谷浓度平均值为（1.43±1.22） μg·mL-1，比与CsA联用时谷浓度明显升高（P ＜ 0.05），这可能是由于FK506可提高MMF的生物利用度，同时抑制了MPA的葡醛酸化所致。值得注意的是，MMF剂量的增加通常伴随着CsA AUC的升高，且糖皮质类激素的剂量与MMF的生物利用度呈负相关[9]。鉴于相关药物间复杂的相互作用，在免疫抑制联合用药方案中，TDM就显得尤为重要。

另外，MPA谷浓度与峰浓度测定结果的分析表明，按单一剂量服用MMF引起的个体差异较大，有效率较低可能与患者病理状态和药物相互作用有关；出院患者血药浓度个体差异较大，可能与服药依从性差有关，因此对于服用 MMF的患者进行TDM具有更重要的临床意义。