鼻咽癌组织中ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白的表达变化及其相关性

饶 洁，赵利容，罗泊涛，陈小毅

(广东医学院病理学教研室，广东湛江524023)

鼻咽癌(NPC)是一种与EB病毒感染密切相关的鼻咽黏膜上皮恶性肿瘤［1］，部分患者起病隐匿、进展快，首诊时已有颈部淋巴结转移或远处转移［2］，目前侵袭和转移仍然是威胁NPC患者生命的关键因素之一。肿瘤细胞侵袭、转移是涉及一系列基因变化的复杂过程［3］，细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路家族中的一员，其异常激活与细胞增殖和部分恶性肿瘤的侵袭、转移密切相关，且可上调基质金属蛋白酶 9(MMP-9)基因表达［4，5］，而 MMPs已被证实在肿瘤侵袭、转移起重要作用［6］。本研究观察了ERK1/2、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)和MMP-9蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况，并分析了三者之间的相关性，旨在为NPC预后判断和抗转移治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 75份NPC组织(NPC组)和27份鼻咽黏膜慢性炎组织(炎性组)标本取自2013年1～7月广东医学院附属医院病理科存档蜡块。NPC组患者中男53例、女22例，年龄25～80岁(中位年龄48.5岁);术前检查鼻咽部均可见新生物，表面粗糙不平，触之易出血，且就诊前未接受放疗或化疗;术后病理诊断均为鼻咽未分化性非角化型癌(WHOⅡ～Ⅲ级)。炎性组患者中男14例、女13例，年龄23～65岁(中位年龄40.2岁);术前检查显示鼻咽黏膜充血粗糙，局部组织增生，表面光滑;鼻咽组织活检证实为鼻咽黏膜慢性炎。

1.2 主要试剂 鼠抗人ERK1/2单克隆抗体、兔抗人p-ERK1/2单克隆抗体均购自Cell Signaling公司;兔抗人MMP-9多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 ERK1/2、p-ERK1/2 和 MMP-9 蛋白的检测方法 采用免疫组织化学染色法。按SP法试剂盒操作说明检测石蜡标本ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白的表达，ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9一抗的工作浓度分别为1∶800、1∶400和1∶150。实验均设置阳性、阴性和空白对照组，阳性对照用已知阳性组织切片，阴性对照用已知阴性组织切片，空白对照组用PBS代替一抗。ERK1/2主要定位于胞质和(或)胞核、p-ERK1/2主要定位于胞核、MMP-9主要定位于胞质，阳性表达者呈棕黄色或棕褐色颗粒分布。免疫组织化学染色法结果判断由两位病理科医生采用双盲法独立评估，其中阳性细胞比例在0、1%～9%、10%～50%和51%～100%者分别计为0、1、2和3分，染色强度为不着色、浅黄色、棕黄色和棕褐色者分别计为0、1、2和3分，上述两种计分乘积＜4判为阴性、≥4判为阳性。

1.4 统计学方法 用SPSS17.0软件进行统计学分析。计数资料以率或构成比表示，比较采用χ2检验或Fisher's精确检验;指标间的关系采用行×列表χ2检验相关法分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种组织中 ERK1/2、p-ERK1/2和 MMP-9蛋白表达 NPC组ERK1/2、p-ERK1/2和 MMP-9蛋白阳性表达率均显著高于炎性组(P均＜0.01)，χ2值依次为 19.8、17.1、21.3。详见表 1。

表1 两组ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白表达比较

2.2 NPC 组织中 ERK1/2、p-ERK1/2和 MMP-9蛋白表达的相关性 NPC组织中ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白三者间的表达呈正相关(P均＜0.01)，其中 ERK1/2 与 p-ERK1/2、MMP-9 蛋白的 r值分别为 0.58、0.34(详见表 2)，p-ERK1/2、MMP-9蛋白的r值为0.34(详见表3)。

表2 NPC组织中ERK1/2与p-ERK1/2、MMP-9蛋白表达的关系(例)

表3 NPC组织中p-ERK1/2和MMP-9蛋白表达的关系(例)

3 讨论

NPC是一种由病毒感染、遗传因素和环境因素等多种因素相互作用引起的上皮源性恶性肿瘤，其发病具有显著的种族和地域特异性，主要好发于我国南方各省及东南亚地区，在我国南方各省的发病率为25/100 000～50/100 000［7］。NPC 的临床病理学具有低分化性和高转移性的特点，以局部淋巴结转移为首发症状就诊的病例高达78.9%，侵袭、转移情况是影响患者预后的主要因素。目前，NPC早期即可发生组织侵袭和淋巴结转移的机制尚不清楚。在诸多影响癌细胞侵袭和转移的相关因素中，ERK1/2、p-ERK1/2和 MMP-9倍受关注，原因为ERK1/2经活化后可促进细胞的增殖分化并使具有破坏局部组织结构和降解基底膜屏障等特性的MMP-9蛋白表达增加，进而提高细胞体外移动能力。

ERK1/2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是MAPK/ERK通路中两个重要的成员。在未受刺激的细胞中，ERK1/2位于胞质，一旦被激活，则以磷酸化状态迅速转移至细胞核，并通过磷酸化反应激活某些转录因子，进而促进细胞增殖分化，抑制细胞凋亡及调节血管生成等［8］，其持续活化最终可促使细胞过度增殖和恶性转化。在卵巢癌［9］、胃癌［10］、非小细胞性肺癌［11］等多种肿瘤组织中均有ERK1/2高表达、ERK1/2磷酸化增加;Manni等［12］发现，体外上调正常乳腺上皮细胞中p-ERK1/2活性可导致其发生恶性转化，推测ERK1/2的活化异常与肿瘤发生、发展密切相关。Hauck等［13］用ERK1/2特异性抑制剂PD98059抑制体外肺腺癌中ERK1/2活化，结果发现生长因子介导的细胞迁移明显受抑，认为ERK1/2活化可能与肿瘤细胞的侵袭、转移有关。本研究结果显示，ERK1/2蛋白及其活化形式p-ERK1/2蛋白阳性表达率在NPC组均显著高于炎性组。表明NPC组织中存在ERK1/2的持续激活，ERK1/2可能参与了NPC的恶性转化。

MMP-9是一种锌离子依赖性内切酶，在肿瘤侵袭和血管发生方面具有独特功能，可通过破坏局部组织结构促进肿瘤生长和肿瘤新血管形成，并通过降解基底膜屏障促进肿瘤转移。黎联等［14］发现，在肺癌细胞中存在p-ERK1/2和MMP-9蛋白高表达，且使用ERK抑制剂PD98059阻断ERK信号通路后MMP-9蛋白表达下降;Byun等［15］发现，在乳腺癌细胞侵袭转移过程中，ERK1/2可通过活化并上调MMP-9蛋白表达调控细胞外基质降解;Inamoto等［16］也发现，ERK抑制剂PD98059体外干预人肾癌细胞可降低氨基丁酸诱导的MMP-9蛋白表达及细胞侵袭能力。故ERK1/2可调控MMP-9表达。新近研究［17］发现，在体外 NPC细胞中，亦可通过ERK1/2活化及使MMP-9启动子活化所需AP-1转录因子Fra-1的激活，诱导MMP-9的mRNA和蛋白表达增加，促进NPC细胞的侵袭。本研究显示，MMP-9蛋白在NPC组阳性表达率达显著高于炎性组，且ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白三者间表达呈正相关。提示p-ERK1/2可能通过调节MMP-9表达参与NPC侵袭、转移，此为NPC临床治疗和预后评估提供了理论依据。

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