Beclin-1表达对舌癌细胞Tca8113顺铂敏感性的影响

陈伟泉，谭广谋，黄文喜，黄海燕

(广州医科大学附属肿瘤医院，广州510095)

舌癌是一种较为常见的口腔颌面部恶性肿瘤，目前治疗以手术(原发灶切除及颈部淋巴结清扫术)为主，围术期辅以放化疗，但化疗耐药的出现严重制约了舌癌的临床治疗。细胞在营养剥夺或其他细胞应激的刺激下可迅速产生大量自噬溶酶体，引发自噬潮、帮助细胞缓解应激或促进细胞凋亡［1］。Beclin-1是参与哺乳动物自噬体形成的关键因子［2］，而自噬在肿瘤的发生、发展、远端转移及化疗耐受中发挥重要作用［3～5］。本研究观察了Beclin-1表达对舌癌细胞Tca8113顺铂敏感性的影响，以期为舌癌的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 舌癌Tca8113细胞购自中国科学院上海细胞库，接种于含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，至对数生长期后用于实验;培养基RPMI1640、胰酶和新生牛血清购自Gibco公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，四唑化合物(MTS)购自Promega公司，顺铂、嘌呤霉素、氨基糖苷类抗生素G418购自Sigma公司，凝胶抽提试剂盒、无内毒素质粒抽提试剂盒Ⅰ购自广州飞扬生物有限公司，BamHⅠ、MluⅠ和 HindⅢ限制性内切酶、蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂购自Fermentas公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce公司，Beclin-1抗体、辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司;ECL化学发光试剂盒购自Millipore公司;引物及干扰片段均由Invitrogen公司合成，其余试剂购自广州威佳生物有限公司。

1.2 过表达和干扰Beclin-1真核载体的构建 在NCBI上获得Beclin-1(NM_003766.3)的序列，使用PP5软件设计Beclin-1过表达的引物(名称及序列略)，以Tca8113细胞cDNA为模板，PCR扩增得到Beclin-1片段。程序如下:94℃ 2 min，98℃ 10 s，68℃ 1 min，35个循环;72℃ 2 min。琼脂糖凝胶回收目的片段，并将其与真核表达载体pLEX-MCS分别用限制性内切酶BamHⅠ和MluⅠ于37℃酶切3 h;琼脂糖凝胶检测酶切效果，回收酶切载体和DNA片段，T4 DNA ligase连接该DNA片段和载体，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单克隆送Invitrogen公司测序，鉴定阳性克隆。利用在线软件BlockiTTM RNAi Designer设计Beclin-1的shRNA序列。在Invitrogen公司合成该干扰片段，95℃ 5 min退火(体系包括5× PCR Buffer 10 μL，上游shRNA序列20 μL，下游 shRNA 序列20 μL);BamH Ⅰ和 HindⅢ酶切载体 pRNAT-U6.1/neo，T4 DNA ligase连接退火片段和酶切后的载体，转化DH5α，挑取单克隆测序，鉴定阳性克隆。RT-PCR和Western blotting法检测重组载体对Beclin-1的干扰效果。

1.3 过表达和干扰Beclin-1的舌癌Tca8113细胞模型的建立 按照Endo-free plasmid mini kitⅠ试剂盒说明书操作，提取经测序鉴定的阳性克隆中的质粒，分别命名为pLEX-Beclin-1和pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2以及pRNAT-Beclin-1-sh3。瞬时转染重组干扰质粒于Tca8113细胞中，RT-PCR和Western blotting方法鉴定各干扰质粒的沉默效果。将质粒pLEX-MCS和pLEX-Beclin-1转染Tca8113细胞，48 h后加入嘌呤霉素(1 g/mL)，逐渐提高嘌呤霉素质量浓度，逐步筛选获得稳定过表达Beclin-1的细胞系Tca8113/Beclin-1及对照细胞系Tca8113/pLEXMCS。同时将pRNAT-U6.1/neo和沉默效果最好的干扰质粒转染Tca8113细胞，48 h后加入300 g/mL的G418，逐渐提高G418质量浓度，逐步筛选获得稳定干扰Beclin-1的细胞系和对照细胞系。

1.4 顺铂干预及细胞存活率检测 取上述对数生长期细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞密度至3×104/mL，按100 μL/孔接种于 96 孔板中，37 ℃、5%CO2的培养箱中过夜。每孔加入质量浓度分别为0、1、2、4、8、16 mg/L 的顺铂100 μL(同时做6 个复孔)，72 h后每孔加入20 μL的MTS，37℃孵育2 h，多功能酶标仪检测490 nm波长处的各孔吸光度A490，计算细胞存活率。实验重复3次，取其结果的平均值。1.5 统计学方法 采用SPSS19.0进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达和干扰Beclin-1真核载体的构建结果 成功构建过表达Beclin-1的真核载体pLEX-Beclin-1及干扰Beclin-1的真核载体pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2 和 pRNAT-Beclin-1-sh3。RT-PCR显示 pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2和pRNAT-Beclin-1-sh3在mRNA水平对Beclin-1的干扰效果分别达到 76.74%、58.21%和 56.53%(P均＜0.05)。Western blotting显示干扰质粒pRNAT-Beclin-1-sh1对Beclin-1的沉默效果最为明显，见图1。因此在后续的研究中仅使用质粒pRNAT-Beclin-1-sh1沉默Beclin-1。

图2 过表达和干扰Beclin-1的稳定舌癌细胞模型

图1 质粒转染Tca8113细胞48 h后Beclin-1蛋白表达

2.2 过表达和干扰Beclin-1舌癌细胞模型的建立结果 用嘌呤霉素筛选获得稳定过表达Beclin-1的细胞模型Tca8113/Beclin-1及对照组细胞模型Tca8113/pLEX-MCS。将 pRNAT-Beclin-1-sh1转染入Tca8113，逐步用新霉素筛选获得稳定干扰Beclin-1的细胞模型Tca8113/pRNAT-Beclin-1-sh1及对照组细胞模型Tca8113/pRNAT-U6.1/neo。RT-PCR显示Beclin-1基因在细胞Tca8113/Beclin-1中的表达量是对照细胞的23.49倍(表达量分别为23.49±1.053、1.00 ±0.003)，在细胞 Tca8113/pRNAT-Beclin-1-sh1中的表达量较对照细胞下调81.64%(表达量分别为 0.18 ±0.001、1.00 ±0.016)，P 均 ＜0.01;Western blotting所示Beclin-1表达变化同上，见图2。

2.3 Tca8113对顺铂的敏感性 Tca8113/pLEXBeclin-1及对组细胞Tca8113/pLEX-MCS对顺铂的半数抑制浓度(IC50)值分别为(11.99±0.34)、(5.03 ±0.16)mg/L，P ＜0.01;而 Tca8113/pRNATBeclin-1-sh1及对照细胞Tca8113/pRNAT-U6.1/neo对顺铂的 IC50值分别为(2.76 ±0.09)、(5.01 ±0.18)mg/L，P ＜0.01。

3 讨论

细胞受到外界刺激或者细胞周期发生改变时即可引发一种程序性细胞凋亡——自噬。自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞自身代谢和某些细胞器更新的需要［6］。越来越多的实验证据表明，自噬与肿瘤的发生、发展密切相关［7，8］。

Beclin-1位于染色体17q21，可与Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的催化亚单位Vps34结合形成复合体，介导其他自噬蛋白定位于前自噬小体，被认为是自噬信号的“守门人”。作为激活自噬的一个重要分子，Beclin-1自身的磷酸化水平和表达量决定自噬水平［9］。Jiang 等［10］发现，35 份头颈部腺样囊性癌组织中32份表达Beclin-1蛋白，其中高表达率为42.9%、低表达率为57.1%，且与患者存活率呈正相关;Liang等［11］在89例头颈部腺样囊性癌组织中得到相同结论。在结肠癌细胞HCT116中，突变的Beclin-1无法被切割而不能引发自噬，可对抗化疗药物引起的细胞凋亡;在实体瘤中，Beclin-1突变能显著降低肿瘤对化疗的敏感性［12］。采用顺铂或者紫杉醇处理肿瘤细胞能够激活细胞的自噬反应，但却使miR-30水平降低;上调miR-30表达后Beclin-1介导的自噬作用显著下调，顺铂诱导的细胞凋亡显著增强［13］。低浓度(10 nmol/L)雷帕霉素可导致大鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3停滞在G1期而引发细胞凋亡，但异位表达Beclin-1后mTOR下游的信号通路可激活自噬，逆转雷帕霉素引起的细胞凋亡［14］。本研究建立了稳定过表达Beclin-1的舌癌细胞模型，且发现其对顺铂的敏感性较对照细胞显著降低;建立了稳定干扰Beclin-1的舌癌细胞模型，且其对顺铂的敏感性较对照细胞显著增加。提示提高Beclin-1表达有助于增强舌癌细胞对顺铂的耐受性，下调Beclin-1表达可增加舌癌细胞对顺铂的敏感性。此为阐述Beclin-1调控舌癌化疗敏感性的分子机制提供了理论基础。

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