胃癌组织中CHD1L表达及其临床意义

袁存存，焦 锋，胡 海

(1河南大学附属郑州市第一人民医院，郑州450004;2上海交通大学)

侵袭与转移是胃癌预后不良的主要生物学特征。染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因(CHD1L)是SNF-2类家族成员，具有高度保守的解旋酶功能，可重组染色质、调控转录以及调节DNA与蛋白质之间的相互作用［1］。研究发现CHD1L阳性表达与多种肿瘤的侵袭、转移以及预后密切相关［2～4］。为探讨CHD1L在胃癌发生发展中的作用，我们于2011年1月～2013年10月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞株AGS、N87、HGC-27(各1株)、正常胃黏膜上皮细胞GES-1由郑州市第一人民医院中心实验室液氮冻存。同期于我院肿瘤外科接受手术的71例胃癌患者的癌组织及其配对癌旁组织(距病灶组织2 cm)石蜡标本(患者男38例，女33例，年龄36～73岁，中位年龄61.6岁;均有完整的临床资料，且经病理检查确诊;肿瘤直径≤5 cm者35例，＞ 5 cm者36例)，TNM 分期:Ⅰ期、Ⅱ期28例，Ⅲ期、Ⅳ期43例;组织学分级:高分化42例，中低分化29例;有淋巴结转移39例。RPMI 1640培基、小牛血清(Gibco公司)，RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(Takara公司)，PCR试剂盒(Takara公司)，CHD1L基因及GAPDH基因引物 (上海生工公司合成)。RIPA裂解液、PMSF、蛋白定量BCA试剂盒(碧云天生物技术公司)，鼠抗人CHD1L单克隆抗体(Abcam公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗体(Cell signaling technology公司)，免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 胃癌细胞株CHD1L mRNA及蛋白表达检测将AGS、N87、HGC-27及GES-1细胞置于10% 小牛血清的RPMI 1640培养液，37℃ 、5%CO2培养箱中饱和湿度下培养。稳定传代2～3代后取对数生长期细胞，分别采用RT-PCR和Western blot法检测CHD1L mRNA和蛋白表达。

1.2.2 胃癌组织及其癌旁组织CHD1L蛋白表达检测 采用免疫组化法。71份胃癌及癌旁组织标本均行4 μm连续切片，S-ABC法染色;二甲苯脱腊，乙醇水化后行抗原修复，4%H2O2阻断10 min，滴加5%BSA封闭液，37℃封闭1 h，滴加一抗4℃过夜(以自身作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照)，生物素化二抗孵育1 h，显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片。于光镜(×400)下每张切片选取5个有代表性的区域，每个区域选150～200个细胞，按染色细胞比例和显色强度计分。染色细胞比例计分:未发现染色细胞为阴性，计0分，染色细胞≤10%、～50%、～80%、＞80%分别计1、2、3、4分;显色强度计分:未着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别计0、1、2、3分。两项计分的乘积＜4为CHD1L蛋白表达阴性，≥4为阳性。分析CHD1L蛋白表达与胃癌临床病理参数的关系。

1.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS13.0软件进行处理，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞系CHD1L mRNA和蛋白表达 3株胃癌细胞 CHD1L mRNA和蛋白均呈高表达，与GES-1细胞比较，P均＜0.05。见图1。

图1 AGS、N87、HGC-27 及 GES-1 细胞CHD1L mRNA和蛋白表达

2.2 胃癌组织及癌旁组织CHD1L蛋白表达 胃癌组织及癌旁组织CHD1L蛋白阳性率分别为49.3%(35/71)、11.3%(8/71)，χ2=24.317，P ＜ 0.05。CHD1L蛋白表达与胃癌临床病理参数的关系见表1。由表1可见，CHD1L蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤直径无关，而与肿瘤TNM分期、分化程度以及淋巴结转移密切相关(P＜0.05)。

表1 CHD1L蛋白表达与胃癌临床病理参数的关系

3 讨论

胃癌的发生发展是多因素、多步骤参与的复杂过程，涉及到癌基因以及转移相关基因的激活、抑癌基因的缺失等［5］。明确胃癌发生发展过程中关键基因的扩增及激活情况，检测胃癌关键基因的表达有助于肿瘤的诊断、分期及预后判断［6，7］。

CHD1L是香港大学关新元教授用染色体显微切割结合筛选杂交技术从人肝细胞的染色体lq21区首次分离并克隆的一个新基因［8］。通过对CHDIL基因的同源性和功能结构域的分析研究发现，其属于 SNF-2类家族。SNF-2类家族成员如Snf2、ISWI和CHDl均含有一个大约400个氨基酸的结构域，具有高度保守的解旋酶功能。CHDIL与CHDl的解旋酶区域的同源序列是59%。与CHDl不同的是，CHDIL不包含可以识别甲基化组蛋白末端染色体结构［9］，但其羧基末端包含一个较大的区域，此为ADP-ribose/PAR-binding元件，可调控DNA损伤修复和细胞周期演进［10，11］。

研究发现，肝癌组织中CHD1L在基因水平扩增的比例是50.6%(86/140)，蛋白水平过表达的比例是52.4%(163/311);转染CHD1L后的肝癌细胞具有更强的致瘤能力［8］。进一步分析发现CHD1L的过表达与静脉浸润、肿瘤分期高、预后差密切相关［3，12］。此外，肝癌手术后患者高表达 CHD1L 者预示着其无疾病生存时间短［13］;膀胱癌组织中CHD1L表达也影响患者的预后以及生存［14］。本研究结果显示，3株人胃癌细胞系中CHD1L mRNA和蛋白表达水平均明显高于正常胃黏膜细胞;71份胃癌组织CHD1L蛋白表达阳性率均明显高于癌旁组织。有报道胃癌组织与癌旁组织的CHD1L阳性率分别为58.7与7.3%，本研究结果与其基本一致，但癌旁组织的阳性率似明显高于其报道，可能与纳入研究者个体差异及免疫组化评分标准不同有关。进一步分析胃癌组织中CHD1L的表达水平与临床病理因素的关系发现，CHD1L蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小无关，而与肿瘤TNM分期、分化程度以及淋巴结转移有关;即CHD1L蛋白表达阳性率高者肿瘤TNM分期高、分化程度低、淋巴结转移率高。CHD1L促进肿瘤生长以及转移的分子机制可能涉及到以下几个方面:①下调肿瘤蛋白p53(TP53)以及TP53蛋白的下游效应基因周期素依赖激酶抑制剂1A，有利于激活周期素E-周期素依赖性激酶2复合物，该复合物能灭活G1/S期磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白，释放转录因子E2F，促进细胞快速进入S期，促进DNA合成，从而调控细胞的增殖及凋亡［3］;②与核受体 4亚族 A组成员 1(NR4A1，又称Nur77)结合，抑制Nur77从细胞核移至线粒体内，阻碍细胞色素C向细胞质释放，抑制细胞凋亡蛋白酶3和蛋白酶9的活性，进而抑制细胞凋亡［15］;③通过细胞分裂周期42鸟苷酸交换因子介导细胞分裂周期42基因的激活，增强细胞的游动性及诱导丝状伪足细胞形成及上皮细胞向间充质细胞转化，增强肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移能力［16］。但CHD1L促进胃癌发生发展的分子机制如何，是否还存在其他的信号通路，仍有待进一步探究。

分析本研究结果，CHD1L蛋白阳性表达。可促进肿瘤的侵袭和转移;CHD1L表达可作为判定胃癌恶性表型的指标之一。今后需进一步对CHD1L在胃癌中的表达水平进行分级并完善随访数据，探讨CHD1L表达水平与患者预后的关系。

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