IQ-G-OBzl对人食管癌细胞体内外抑制作用的研究

杨国栋，张晓英，冯志松，任 权，江毅敏

(1川北医学院附属医院，四川南充637000;2川北医学院基础医学院)

据统计，全世界每年约有30万人死于食管癌［1～4］;我国每年约15万人死于食管癌，居世界首位［4，5］。食管癌的治疗以手术、放疗等创伤较大的治疗方式为主，目前尚无有效的治疗药物［6，7］。N-异喹啉-3-羧酸-L-甘氨酸苄酯(IQ-G-OBzl)是将L-甘氨酸苄酯引入3-羧酸氧化异喹啉的3羧基端所得到的一种含氧化喹啉结构的新化合物［8］;Zheng等［8］研究表明其可抑制宫颈癌细胞Hela及人早幼粒白血病细胞HL-60生长。研究表明氧化喹啉可通过DNA扦插，损伤肿瘤细胞DNA达到抑制肿瘤细胞的作用［9～13］，但具体机制尚不清楚。研究发现，活性氧(ROS)在细胞DNA损伤中占有重要地位，氧化喹啉类化合物可能通过提高细胞内活性氧(ROS)水平损伤肿瘤细胞 DNA［14～16］，但需进一步验证。2013年1～10月，我们观察了IQ-G-OBzl体内、外对人食管癌细胞生长的抑制作用及其对肿瘤细胞内ROS水平的影响，初步探讨IQ-G-OBzl抗食管癌的作用机制，旨在为其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管癌细胞Eca-109及EC-9706购于中国科学院上海细胞所。N-异喹啉-3-羧酸-L-甘氨酸苄酯按Zheng等［8］的方法合成，高压灭菌后4℃保存备用;氟脲嘧啶注射液(5-FU)由上海旭东海普药业有限公司生产，产品批号:040805。SPF级Balb/C裸小鼠(5周龄，雌性，体质量18～20 g)购自中国医学科学院肿瘤研究所。

1.2 体外实验

1.2.1 IQ-G-OBzl对食管癌细胞生长的影响的观察取指数生长期Eca-109及EC-9706细胞分别接种于96孔板并分为四组。5-FU组、L-甘氨酸苄酯组、3-羧酸异喹啉组及IQ-G-OBzl组分别给予100、1 000及10 000 nM的相应药物干预。作用20 h后加入MTT 20 μL(5 mg/mL)，37℃孵育4 h后弃去上清，加DMSO 100 μL，微量振荡仪振荡10 min至结晶完全溶解，扫描分光酶标仪读取A490，细胞生长抑制率=［(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%］。计算IC50值。

1.2.2 IQ-G-OBzl对食管癌细胞ROS水平的影响的观察 将Eca-109及EC-9706细胞分为L-甘氨酸苄酯组、3-羧酸异喹啉组、IQ-G-OBzl组及生理盐水组，除生理盐水组外，其余各组用400 nM的相应药物干预。干预后予120 μmol/L的双氢罗丹明123(Rh123)，37℃ 孵育24 h后收集 Eca-109及 EC-9706细胞，以PBS漂洗一次后上机检测Rh 123荧光强度即代表Eca-109、EC-9706细胞的ROS水平。

1.3 体内实验

1.3.1 食管癌裸鼠模型制作及干预 115只裸鼠饲养于SPF屏障系统中(饲料、水及其用具均经灭菌处理)。对数生长期人食管癌Eca-109细胞株，PBS清洗后制成1×1010/mL细胞悬液，0.1 mL接种于裸鼠皮下。将115只荷瘤鼠分为五组。生理盐水组(15只)予生理盐水0.2 mL灌胃，L-甘氨酸苄酯组(30只)、3-羧酸异喹啉组(30只)及IQ-G-OBzl组(30 只)分别予1、10、100 μmol/kg 的相应药物灌胃(每剂量10只)，5-FU 组(10只)予100 μmol/kg的5-FU灌胃;均每日1次。

1.3.2 观察项目 ①大鼠存活率:统计实验过程中大鼠自然死亡率(非处死)。②肿瘤生长抑制率(抑瘤率):于灌胃第28天处死动物，剥离肿瘤并称重。抑瘤率=(对照组肿瘤重量-实验组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100%;③外用血白细胞数量:处死大鼠时摘除眼球取血计数白细胞。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件行统计学处理。采用单因素方差分析，所有数据均用±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外实验结果

2.1.1 IQ-G-OBzl对食管癌细胞生长的影响 各组IC50比较见表1。由表1可见，IQ-G-OBzl组Eca-109及EC-9706的IC50值均低于L-甘氨酸苄酯组及3-羧酸异喹啉组，但高于5-FU组(P＜0.05);IQ-G-OBzl组Eca-109细胞的 IC50低于EC-9706细胞(P＜0.05)。

表1 各组干预药物对细胞的IC50比较(n=6，±s)

表1 各组干预药物对细胞的IC50比较(n=6，±s)

注:与L-甘氨酸苄酯组、3-羧酸异喹啉组及5-FU组比较，△P＜0.05;与 EC-9706 细胞比较，*P ＜0.05

IC50组别384.74 ±25.00 435.58 ± 39.38 Eca-109细胞 EC-9706 1 052.80 ± 76.58 3-羧酸异喹啉组 1 538.94 ±94.68* 1 738.78 ±101.23 IQ-G-OBzl组 498.42 ±51.33△＊ 529.85 ± 32.86△5-FU组细胞L-甘氨酸苄酯组 973.78 ±78.80*

2.1.2 IQ-G-OBzl对食管癌细胞ROS水平的影响除3-羧酸异喹啉组外，L-甘氨酸苄酯组、IQ-G-OB-zl组细胞内 ROS水平均高于生理盐水组(P＜0.05);L-甘氨酸苄酯组及3-羧酸异喹啉组均低于IQ-G-OBzl组(P ＜0.05)，见表2。

表2 各组细胞内ROS水平比较(n=6，±s)

表2 各组细胞内ROS水平比较(n=6，±s)

注:与生理盐水组比较，△P＜0.05;与 IQ-G-OBzl组比较，*P＜0.05

组别ROS(mFl)EC-9706 L-甘氨酸苄酯组 62.68±5.37△＊ 59.85±8.87 Eca-109△＊19.89 ±2.35 21.22 ±3.07 3-羧酸异喹啉组 15.21 ±3.01* 19.02 ±4.44*IQ-G-OBzl组 88.07 ±9.99△ 76.67 ±7.37△生理盐水组

2.2 体内实验结果

2.2.1 大鼠存活率 5-FU组存活6只，存活率为60%，生理盐水组存活10只，存活率为66%，L-甘氨酸苄酯组、3-羧酸异喹啉组、IQ-G-OBzl组均存活，存活率为100%。

2.2.2 瘤重及抑瘤率 各组瘤重及抑瘤率见表3。由 表3可见，IQ-G-OBzl组、L-甘氨酸苄酯组及3-羧酸异喹组瘤重均低于生理盐水组、但均高于5-FU组;抑瘤率均低于5-FU组(P均＜0.05);随用药剂量升高瘤重降低、抑瘤率升高;IQ-G-OBzl组瘤重低于、抑瘤率高于L-甘氨酸苄酯组及3-羧酸异喹组(P均 ＜0.05)。

表3 各组瘤重及抑瘤率比较(±s)

表3 各组瘤重及抑瘤率比较(±s)

注:与生理盐水组及5-FU组比较，*P＜0.05;与L-甘氨酸苄酯组及3-羧酸异喹啉组同剂量比较，#P＜0.05

组别 n 瘤重(g) 抑瘤率(%)10 1.91 ±0.12 L-甘氨酸苄酯组1 μmol/kg 10 1.79 ±0.14* 6.09 ±0.61*10 μmol/kg 10 1.70 ±0.10* 10.55 ±0.96*100 μmol/kg 10 1.65 ±0.24* 13.39 ±1.06*3-羧酸异喹啉组1 μmol/kg 10 1.79 ±0.37* 6.04 ±1.01*10 μmol/kg 10 1.75 ±0.18* 8.14 ±0.99*100 μmol/kg 10 1.71 ±0.51* 10.24 ±2.22*IQ-G-OBzl组1 μmol/kg 10 1.68 ±0.22*# 11.81 ±1.99*#10 μmol/kg 10 1.41 ±0.29*# 25.98 ±4.44*#100 μmol/kg 10 1.26 ±0.29*# 33.86 ±4.58*#5-FU组生理盐水组6 0.88 ±0.25 52.76 ± 8.37

2.2.3 外周血白细胞数量 各组外周血白细胞数比较见表4。

表4 各组外周血白细胞数比较(±s)

表4 各组外周血白细胞数比较(±s)

注:与生理盐水组比较，*P＜0.05;与5-Fu组比较，#P＜0.05;与 IQ-G-OBzl组同剂量比较，ΔP ＜0.05

组别 n 白细胞数量(×109/L)10 4.53 ±0.78 L-甘氨酸苄酯组1 μmol/kg 10 4.68 ±0.39#10 μmol/kg 10 4.42 ± 0.97#100 μmol/kg 10 4.65 ± 0.24#3-羧酸异喹啉组1 μmol/kg 10 4.44 ±0.51#10 μmol/kg 10 4.39 ± 0.73#100 μmol/kg 10 3.41 ± 0.35*#Δ IQ-G-OBzl组1 μmol/kg 10 4.51 ±0.87#10 μmol/kg 10 4.58 ± 0.68#100 μmol/kg 10 4.93 ± 0.94#5-FU组生理盐水组3.04 ±0.50 6

3 讨论

IQ-G-OBzl由 Zheng等［8］发明后并研究证明其对宫颈癌细胞及人早幼粒白血病细胞有良好的抗肿瘤作用，但其对食管癌的研究鲜见报道。本研究选用的Eca-109及EC-9706分别为高分化鳞癌及低分化鳞癌细胞，研究表明L-甘氨酸苄酯、3-羧酸异喹及IQ-G-OBzl对Eca-109及EC-9706体外均有抑制作用，但IQ-G-OBzl组的IC50明显低于L-甘氨酸苄酯及3-羧酸异喹啉组，而高于5-FU组，表明将L-甘氨酸苄酯及3-羧酸异喹啉化合可以提高抑瘤作用;IQG-OBzl对 Eca-109细胞的 IC50低于 EC-9706细胞株，提示其可能对高分化鳞癌抗肿瘤效果更佳。

本研究结果显示，随着L-甘氨酸苄酯、3-羧酸异喹啉及IQ-G-OBzl剂量的升高，裸鼠瘤重降低，抑瘤率升高，IQ-G-OBzl组瘤重低于、抑瘤率高于L-甘氨酸苄酯及3-羧酸异喹啉组，证实IQ-G-OBzl在体内有良好的抑制食管癌作用，与体外研究结果一致。

本研究体内实验结果显示，L-甘氨酸苄酯组、3-羧酸异喹啉组及IQ-G-OBzl组外周血白细胞数及大鼠存活率均高于5-FU组，可能原因为5-FU的毒副作用较大;其外周血白细胞数量与生理盐水组无明显差异;但3-羧酸异喹啉组100 μmol/kg干预者外周血白细胞低于生理盐水组，可能与3-羧酸异喹啉含有苯环结构，可导致骨髓抑制有关。IQ-G-OBzl组外周血白细胞数无明显降低，可能与氧化喹啉结构可以降低苯导致的骨髓抑制有关，具体机制尚不清楚，需进一步探讨。

本研究结果显示，L-甘氨酸苄酯组、3-羧酸异喹啉组及IQ-G-OBzl组Eca-109及EC-9706内ROS水平均高于生理盐水组，3-羧酸异喹啉组与生理盐水组比较无明显差异;证实IQ-G-OBzl可提高食管癌细胞内ROS的水平，其机制尚不明确;3-羧酸异喹啉无明确升高ROS水平的作用，推测其可能通过其他途径抑制食管癌细胞生长。IQ-G-OBzl组ROS水平高于L-甘氨酸苄酯组，原因可能是L-甘氨酸苄酯与3-羧酸异喹啉化合物结合后影响了IQ-G-OBzl的立体结构。IQ-G-OBzl组EC-9706细胞内ROS水平低于Eca-109细胞，与体外细胞实验结果一致。

综上所述，IQ-G-OBzl体内、外对食管癌细胞均有抑制作用，其作用机制与其可提高细胞内ROS水平有关。IQ-G-OBzl抗食管癌的作用较5-FU低，但其对外周血细胞的影响也较小，且动物模型存活率较5-FU组高，有良好的应用前景。

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