何杰
( 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室,江苏无锡214081)
孙兴驰,隋东海
(南京农业大学无锡渔业学院,江苏 无锡214081)
淡水石斑鱼(Cichlasoma managuense)隶属鲈形目(Perciformes)鲡鱼科(Cichlaidae)丽体鱼属(Cichlasoma),原产于中美洲,属名贵鱼类,1988年引入台湾,1996年从台湾引入大陆,成为淡水养殖的一个新品种[1]。目前,淡水石斑鱼在重金属毒性试验[2-3]、含肉率和肌肉营养成分分析[4]、血细胞发生的观察[5]、人工繁殖[6]、养殖[7-8]及病害防治[9]等方面已有一些研究,但其胚胎发育尚未见报道,而且丽体鱼属中也未见有胚胎发育方面的报道,但鲡鱼科中尼罗罗非鱼(Oreochrimis nilotica)[10-12]、莫桑比克罗非鱼(Oreochrimis mossambca)[13]、盘丽鱼(Symphysodon discus )[14]、神仙鱼(Pterophyllums carale)[15]的胚胎发育均有报道。本研究探讨了淡水石斑鱼胚胎发育的特征,以为鱼苗的繁殖培育、品种改良提供基础依据。
2010年6月从福建漳州购入一批淡水石斑鱼水花,在淡水渔业研究中心宜兴实验基地养殖,2012年5月从越冬池中选择个头较大、身体强壮的雌雄鱼各100尾,雌雄分开在温室内进行强化培育。
在7月初,挑选腹部发白、膨大明显、颜色较淡的雌鱼和体色鲜艳、身体强壮的雄鱼,单尾重300~400g。在温室内进行人工繁殖,20:00时注射催产素,雌鱼每千克体重注射脑垂体1.5~3mg+HCG 800~1000IU;雄鱼剂量减半。注射后的雌、雄亲鱼用网箱分开放,池内充气增氧,DO为8mg/L左右,水温28℃。清晨5:00时,将4尾雌鱼、6尾雄鱼放入同一只网箱,让其自然交配。此时,留人静候观察,发现雌鱼产卵受精时开始计时,进行胚胎发育观察。淡水石斑受精卵呈粘性,成片附着在网箱的网片上,刚产出为白色,遇水不久变为光泽的水色。结果交配的3只网箱,均有产卵。
在水面下向网箱内轻折附有受精卵的网片时有许多卵粒脱落,用洁净培养皿取得脱落卵粒,然后在Olympus生物显微镜下观察胚胎发育,并连接电脑放大成像。轻轻晃动培养皿,立体观察,详细记录不同时间的发育特征,同时进行显微摄影。观察环境水温(25.7±0.3)℃,每2h换水1次以保持胚胎正常发育。
在水温(25.7±0.3)℃的环境中,淡水石斑鱼的胚胎发育从受精卵开始至早期鱼苗,历时达56h,其中的35个阶段显著特征详见表1。其胚胎发育过程可划分为8个时期:胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期、出膜期、卵黄期。
表1 淡水石斑鱼胚胎发育期及其特征
淡水石斑鱼受精卵为椭圆形,短轴(1.19±0.11)mm,长轴(1.51±0.13)mm,半透明,卵黄囊占据绝大部分体积,可见卵黄颗粒,动物极浅红色(图1-1)。受精几分钟后,动物极颜色逐渐变深同时隆起形成胚盘(图1-2),至32min后,胚盘高度不再变化并积累营养物质为卵裂作好准备(图1-3)。
受精后41min,卵裂开始发生,仅在动物极的胚盘正中央出现直线状淡色沟,并逐渐加深,胚盘一分为二(图1-4),然后两侧分别收缩并隆起,至1h9min时,形成2个大小均一馒头状细胞,完成第1次卵裂(图1-5);第2~4卵裂与第1次分裂方向垂直。至1h20min完成第2次分裂,形成形状大小一致的4个分裂球进入4细胞期(图1-6);分裂球的中部逐渐形成缢痕,至1h47min完成第3次分裂,形成8个形状大小基本一致的分裂球进入8细胞期(图1-7);第4次出现不同步分裂,有的细胞已分开,有的还连接在一起,形状大小也产生差异,至2h2min完成第4次分裂进入16细胞期(图1-8);至2h19min完成第5次分裂,进入32细胞期,细胞分裂呈不规则两层,细胞大小也不尽相同(图1-9);至2h48min细胞又完成第6次分裂,细胞显著减小,进入64细胞期(图1-10);细胞越分越细,位于中央部分细胞分裂较快,长方形细胞团变成半球形,至3h14min进入多细胞期(图1-11);细胞分裂至3h49min时,细胞密集但仍可见单个细胞,随后分裂细胞团四周收缩,高度逐渐增加,进入桑葚期(图1-12)。
受精后4h55min进入囊胚期,细胞分裂更细,难以见到单个细胞,层数不断增加叠起,最终呈僧帽状的高囊胚期(图1-13);接着僧帽状边沿向下铺展,囊胚细胞向四周延伸,囊胚高度逐渐降低,至5h57min类似早期胚盘(四周与卵黄交界处有亮环而与胚盘相异),进入平囊胚期(图1-14)。
受精后7h16min进入原肠胚早期,囊胚细胞开始从动物极下包植物极,可见囊胚腔和早期胚环(图1-15),下包至1/5处时胚环显著,囊胚腔缩小(图1-16);至8h23min下包至1/2处,形成原肠胚中期,可见胚盾,胚盾始于动物极止于胚环(图1-17);在继续下包过程中,胚环形成的缢痕逐渐加深,胚盾显著增粗并与胚环一起下移并延伸(图1-18),至9h48min下包至2/3处,胚盾颜色开始转淡,下包过程中卵黄囊被挤而部分凸出胚环外,进入原肠胚后期(图1-19);至10h50min下包至4/5,进入原肠胚末期,卵黄囊小部分被挤而突出形成泡状(图1-20)。
受精卵发育至11h47min时出现神经胚,胚体头部增高,出现脑泡,初现胚体轮廓,卵黄囊即将被包完,部分卵黄凸出似脱痣状卵黄栓(图1-21);发育至11h52min,胚孔即将封闭,呈火山状,胚体头前端有细管连接。胚体索状,向外凸出卵膜外成脊,向内挤压卵黄囊成沟(图1-22);至13h19min,神经胚头端抬起,出现体节,黑色素开始大量出现,体节延伸到植物极底端(图1-23)。
2.6.1 泡形成期
受精后16h23min,尾部出现透明小泡,介于卵膜与卵黄囊之间,体节较粗壮,视芽(视泡前身)可见(图1-24);至21h11min,胚体扭动,胚尾扭转,挣脱膜的束缚,在卵膜与卵黄囊之间露出游离空间(图1-25),进入尾芽期;至23h9min,胚体头部两侧出现隆起形成泡状,进入视泡期(图1-26);至27h43min,视泡后出现较小泡状物为听泡,此时胚体头前端有一小管连接,可见管内流动淡红色液体(图1-27)。至30h36min出现脑泡,胚体头部初具鱼苗头部轮廓,卵黄囊上开始出现黑色素颗粒(图1-28)。
2.6.2 心脏期
受精后34h29min为心脏前期,出现透明状管泡状物即心芽,胚体头前端管状物粗大,管内液体流动速度很快不易察觉,动物极下的卵黄过分吸收具明显缺刻(图1-29、图1-30),胚体头部进一步发育体积增大近1倍(图1-30);至38h37min,可见圆环形晶体轮廓(图1-31),晶体环由不同的弧形小片组成;至38h56min为心脏中期,胚体头前端管膨大呈囊状,镶嵌于卵黄囊上,可见有液体从卵黄囊四周流向胚体头部(图1-32,1-33);至43h26min,胚体异常活跃有力,胚体长度为此时卵径周长的3/4,在卵黄囊与卵膜之间间歇性摆动4~5秒扭动1次,卵黄囊被挤压呈不同形状(图1-34);至47h 39min为心脏后期,心脏跳动有力,心率为38,胚体头前端囊状管液体流呈红色(图1-35)。
2.6.3 血液循环期
受精后48h53min进入血液循环前期,囊状管向卵膜一端分出4分支小管,为血液流出方向,可见小管内有快速流动的血液(图1-36、1-37);至49h58min为血液循环后期,可见囊状管向卵黄囊一端有4支粗管,为血液流入方向,小管内血液颜色较鲜艳,心率增加至53(图1-38、1-39)。
受精后52h24min,胚体运动挤压卵黄囊,囊状管被埋入卵黄囊内,尾尖处卵膜首先瞬间爆裂,内容物和卵黄苗被弹出(图1-40)。至56h53min,为卵黄苗前期,鱼苗呈弯曲状,身体前部附着在卵黄囊上(图1-41);至77h46min,为卵黄苗后期,鱼苗身体平直透明,游动有力,卵黄囊显著缩小(图1-42)。鱼苗孵出后会挤在一起尾部朝同一方向不断摆动,形成微环循水体,此后进入亲鱼护崽阶段。
淡水石斑鱼属分批产卵热带鱼类,在繁殖季节很难判断雌鱼体内卵子发育的成熟情况,繁殖前雌雄分开进行强化培育十分必要,否则人工繁殖较难获得成功。孵化水温对鱼苗繁殖具有重要意义,从48种鱼类平均温度和发育时间来看,平均温度增高,发育时间缩短[16],如冷水性鱼类山女鳟(Oncorhynchus masou masou)低于4℃比8℃时的孵化时间要长30d[17],淡水石斑鱼在水温26~29℃时,48h可孵出仔鱼[1]。本研究采用孵化水温近26℃,孵化时间为56h,孵化水温还有提升的空间。
淡水石斑鱼胚胎发育从第4次分裂起,分裂相细胞排列趋向紊乱,不如泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)[18]、胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)[16]等鱼类分裂细胞排裂整齐。受精卵外观和发育与同科的盘丽鱼胚胎发育较为近似[14],与同科的罗非鱼相比,后者受精卵为卵圆形,动物极较尖,淡黄色不会遇水变得透明,发育过程中的血管系统也不如淡水石斑鱼发达[10-12]。
淡水石斑鱼胚胎发育形成了较为复杂的胚胎血液环循系统,其卵黄囊较软,胚环的下移和胚体的活动都能轻易改变其形状,这些特征与运动相关因此需氧量也相对较高,所以淡水石斑鱼胚胎发育耗氧较高,所以有亲鱼护卵习性,用鳍扇动水流,从而增加氧气,否则受精卵会发白,不久即死亡。
在心脏形成中、后期,胚体头部端管膨大成囊状,内部流动着无色液体也转化为淡血色至鲜红色,囊状物类似心脏,但无搏动现象,末起到心脏搏动提供动力作用,后来其发育去向不明,其原因还需要做进一步研究。同时在心脏中、后期和出膜前期,胚体也异常活跃,对环境条件的变化也比较敏感,通过观察发现,此阶段如从25.7℃降至18℃,出膜后的鱼苗出现水泡胸,不久死亡。幼苗破膜而出同时伴有大量的废物质释放,水质易恶化,所以在受精卵在出膜阶段,适宜的水温和丰富的溶氧有利于幼苗成活和正常发育。
[1]刘永华,周海平,沈卫红.淡水石斑鱼的生物学特性与养殖技术 [J].广西水产科技,2000,(4):23-25.
[2]何斌,何利君,杜军,等.4种重金属离子对淡水石斑胚胎及仔鱼急性毒性的研究 [J].水利渔业,2006,26(4):94-95,106.
[3]段彪,黄文清.4种重金属离子对淡水石斑胚胎及仔鱼的毒性试验 [J].南方农业,2008,2(7):19-20.
[4]黄海,杨宁,张希.淡水石斑鱼含肉率和肌肉营养成分分析 [J].水产科技情报,2012,39(2):87-91.
[5]顾曙余,杜寅,丁力,等.淡水石斑外周血细胞显微结构观察 [J].动物学杂志,2007,42(6):115-119.
[6]黄薇,周文玉,张富乐.淡水石斑鱼人工繁殖技术研究 [J].水产科技情报,2003,30(3):106-108.
[7]陈迪虎.淡水石斑鱼的温室养殖试验 [J].水产科技情报,2006,33(1):15-16.
[8]吴震亮.淡水石斑鱼的网箱养殖技术 [J].福建农业,2012,(5):29.
[9]马怀忠.淡水石斑鱼常见病害及防治 [J].渔业致富指南,2010,(20):47-48.
[10]王令玲,仇潜如.尼罗罗非鱼胚胎及胚后发育的观察 [J].动物学报,1981,27(4):327-335.
[11]刘筠,刘国安,陈淑群,等.尼罗罗非鱼性腺发育的研究 [J].水生生物学集刊,1983,8(1):17-32.
[12]Fujimura K,Okada N.Development of the embryo,larva and early juvenile of Nile tilapia Orechromis niloticus(Pisces:Cichidae)Developmental staging system [J].Development,growth &differentiation,2007,49:301-324.
[13]王楚松.罗非鱼的养殖 [M].北京:农业出版社,1981.
[14]童永,沈建忠.盘丽鱼胚胎发育的研究 [J].安微农业科学,2008,36(7):2633-2635.
[15]周玉,杨振国,张俊辉.神仙鱼胚胎和仔鱼发育的初步观察 [J].上海水产大学学报,2001,7(4):370-373.
[16]万远,占阳,欧阳珊,等.胭脂鱼胚胎及仔鱼早期发育观察 [J].南昌大学学报(理科版),2013,37(1):78-82.
[17]范兆廷,姜作发,韩英.冷水性鱼类养殖学 [M].北京:中国农业出版社,2008.
[18]ZHANG Yu-ming,TIAN Xiu-e,WANG Yong-jun.Research on Embtyonic Development of loach [J].Agricultural Science &Technology,2010,11:125-128.