大菱鲆胚胎生长与核酸关系的研究

佟雪红 ，汤新慧，鲍成满，杨小兰，陈　倩，陶　萍

(1.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室，江苏 盐城 224051;2.盐城师范学院 海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051)



大菱鲆胚胎生长与核酸关系的研究

佟雪红1，2，汤新慧2，鲍成满2，杨小兰2，陈倩2，陶萍2

(1.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室，江苏 盐城 224051;2.盐城师范学院 海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051)

对大菱鲆胚胎发育过程进行观察，研究胚体的生长性能以及核酸、蛋白的变化，分析生长性状与生化指标间的关系。结果表明：(1) 在不同发育时期，大菱鲆胚体长度呈现“缩小—膨大—再缩小—再膨大”的变化过程，在受精后5 h 40 min出现最小值0.998 mm，在孵化期出现最大值1.089 mm。(2) 油球在卵裂期之前逐渐增大，在卵裂期之后逐渐缩短；在受精后9 h 40 min的多细胞期达到最高值0.192 mm，在受精后65 h达到最低值0.176 mm。(3) 胚体质量在原肠期之前呈增大趋势，原肠期之后呈降低趋势；在受精后7 h 30 min的128细胞期出现最低值0.340 mg，在9 h 40 min的多细胞期出现最高值0.674 mg。(4) RNA/DNA和蛋白质/DNA比率变化表明，大菱鲆胚胎发育至卵裂期后，胚体的生长以细胞增殖为主直至囊胚期；之后胚体生长以细胞增大为主直至原肠期；胚胎发育至原肠期后，胚体的生长以细胞增殖为主直至器官形成期；之后胚体生长以细胞增大为主直至孵出；即大菱鲆胚体的生长是细胞增殖和细胞增大周期性交替的过程。(5) 胚胎形态性状和胚体质量跟生化指标间均为“二项式”关系，而且RNA/DNA比率是与胚胎生长性状关系密切的指标。

大菱鲆；胚胎发育；核酸；RNA/DNA

大菱鲆属于鲽形目鲆科，在中国又称“多宝鱼”，身体扁平近似圆型，双眼位于左侧。大菱鲆生长迅速，具有经济价值高、饵料转换率高、抗病力强、耗氧量低等优点，适合高密度养殖[1]。据统计，在2009年，大菱鲆产量占到鲆鲽鱼类总产量的55%，是我国重要的经济养殖品种[2]。

鱼类的生长性能是评价其品质的重要指标，关于外界因素对大菱鲆生长发育影响的研究已有一些报道，雷霁霖等[3]详细描述了大菱鲆胚胎和仔稚鱼的发育；苗淑彦等[4]分析了添加不同种类的碳水化合物对大菱鲆幼鱼生长、成活以及鱼体生理生化指标的影响；阿荣等[5]研究了周期性饥饿再投喂对大菱鲆幼鱼生长和能量收支的影响，等等。但是，关于大菱鲆胚胎期生长发育的研究较少，而胚胎长度、油球直径、胚体质量的变化是胚体生长的具体表征，因此，通过测定上述指标可以明确胚体在不同发育期的生长状况，对优化饲育管理以及其他相关工作的开展均有重要的指导意义。

此外，有资料显示，鱼体的生化指标，如核酸含量、总蛋白含量、RNA/DNA比率等，能精确反映出其生长的细微变化[6-9]，在传统方法尚不能度量出鱼类生长的变化时，生化指标就能够反映出鱼类生长的细微变化和食物分布的波动，通过确立这些生化指标跟生长的数量关系，能够进一步借助于上述生化指标评价仔稚鱼的生理状况，这对于改善养殖管理条件有重要的应用价值。近年来，以核酸和总蛋白为基础的生化指标已广泛用于评估鱼类胚后发育阶段仔稚鱼的生长，比如欧鲽[9]、牙鲆[10]、鲫鱼[11]、鲈鱼[12]、黑线鳕[13]、罗非鱼[14]等。笔者对大菱鲆仔稚鱼生长与生化指标的联系也进行了详细探讨[15]，但上述工作都是围绕胚后阶段仔稚鱼和幼鱼的发育开展的，而大菱鲆胚胎期生长状况及其与生化指标关系的研究尚未见报道。为此，我们以大菱鲆胚胎为研究对象，通过测定胚体长度、胚体质量、油球直径、核酸和蛋白含量来研究胚体的生长特性，阐明胚胎生长指标与生化指标间的数量关系，以期为完善大菱鲆的人工育苗技术提供基础资料。

1　材料与方法

1.1材料

大菱鲆胚胎发育实验于2014年4月在山东莱州大菱鲆育苗场进行。实验用雌、雄亲鱼均取自亲鱼驯养池，将亲鱼人工催产后进行受精，将品质较好的浮性卵移入孵化网箱进行孵化培育。

1.2方法

1.2.1胚胎发育的观察

胚胎孵化过程中水温为(14.4±0.5)℃，盐度为31‰～33‰，pH 为7.9～8.3。用奥林巴斯显微镜(BX41)观察胚胎的发育过程并确定发育期。

1.2.2样品采集

在胚胎的不同发育期连续采样，首先，每个发育期随机取样80粒，用于测定胚胎的长度、油球的直径以及胚体质量；其次，每个发育期随机取样100 mg，速冻于液氮中，用于测定胚体核酸和蛋白含量。

1.2.3测定方法

形态性状和胚体质量的测定：40粒样品用于胚体长度和油球直径的测定，采用与显微镜配套的电子目镜进行测量；另外40粒在吸干水分后测定其质量，用电子天平进行测量。

核酸和蛋白含量的测定：实验样品核酸物质的测定采用Tong等[15]的方法进行，在此基础上略做修改，匀浆时的质量体积比调整为1∶8。蛋白含量的测定依据Bradford[16]的方法进行。

1.3数据分析

用Excel软件对实验数据进行统计分析，得出平均值和标准差，将实验数据表示为平均值±标准差的形式，并建立胚体形态性状、胚体质量和生化指标不同时期的变化趋势图。采用SPSS 11.0 软件进行方差分析，对胚体不同时期的形态性状、胚体质量、生化指标分别进行多重比较；同时，对胚体的形态性状、胚体质量与生化指标进行多元回归分析，建立回归方程。

2　结果与分析

2.1不同发育期大菱鲆胚体长度

大菱鲆胚胎生长过程中，其长度整体呈增大趋势。但在不同的发育期，胚体大小变化明显，呈现出“缩小—膨大—再缩小—再膨大”的状态。如图1所示，实验过程中，胚胎长度最小值为0.998 mm，出现在受精后5 h 40 min；最大值为1.089 mm，出现在受精后103 h，即孵化出膜时。根据不同发育时期胚体长度的平均值得出，受精卵到卵裂期呈缩小趋势并在卵裂期达到最低值1.015 mm；之后保持增大状态直至囊胚期(1.057 mm)；从囊胚期至原肠期，胚体再次出现缩小状态，并在原肠期时达到1.045 mm；之后胚体保持膨大状态直至孵化(1.089 mm)。

2.2不同发育期胚体油球直径

不同发育时期，大菱鲆胚体中油球直径变化如图2所示。从受精卵到卵裂期，油球整体保持增长趋势，并且在受精后9 h 40 min的多细胞期，油球直径呈现最高值0.192 mm；在受精后17 h 10 min的原肠早期，油球直径降为0.181 mm；之后，油球呈波动性增长并在47 h 50 min的器官形成早期达到0.189 mm；在受精后65 h，油球直径达到最低值0.176 mm；此后，油球缓慢增长并在受精后86 h的心跳出现期达到0.186 mm；在103 h的孵化期，油球直径降为0.180 mm。根据不同发育时期油球直径的平均值得出，油球直径从受精卵至卵裂期逐渐增大并在卵裂期达到最高点0.186 mm；之后逐渐缩短，在囊胚期、原肠期、器官形成期、孵化期分别达到0.185，0.184，0.183，0.180 mm。随着生长发育进行，油球长度逐渐减少，说明胚体对油球中脂类和脂肪酸的利用比率逐渐增加。

横轴中数字代表发育期，各个发育期对应的受精后时间分别为：0为刚受精的受精卵；1为3 h 10 min；2为3 h 40 min；3为4 h 40 min；4为5 h 40 min；5为6 h 50 min；6为7 h 30 min；7为9 h 40 min；8为10 h 40 min；9为11 h 50 min；10为17 h 10 min；11为24 h；12为29 h 30 min；13为36 h；14为39 h 10 min；15为47 h 50 min；16为56 h 50 min；17为65 h；18为72 h 30 min；19为79 h 35 min；20为86 h；21为103 h。其中：0为受精卵，1～7为卵裂期，8～9为囊胚期，10～14为原肠期，15～20为器官形成期，21为孵化期。图中无相同字母数据间表示差异显著(P<0.05)。下同。图1　不同发育期大菱鲆胚体长度Fig.1　Embryonic length of turbot during different developmental stages

图2　不同发育期胚体油球直径Fig.2　Oil globule diameter of embryo during different developmental stages

2.3不同发育期胚体质量

不同发育期，大菱鲆胚体质量如图3所示。胚体质量从受精卵到卵裂期变化比较剧烈，在受精后4 h 40 min出现第一个高峰值0.627 mg，在7 h 30 min的128细胞期出现最低值0.340 mg，在9 h 40 min的多细胞期出现最高值0.674 mg；从10 h 40 min进入囊胚期开始，胚体质量呈现平稳的波动直至79 h 35 min的器官形成期末期，此后胚体质量急剧降低并在孵化期时达到0.373 mg。根据不同发育时期胚体质量的平均值得出，胚体在卵裂期体质量为0.509 mg；之后快速增长并在原肠期达到最高值0.574 mg；此后急剧降低，在孵化时胚体质量达到最低值0.373 mg，较之原肠期，降幅为35.0 %。

2.4不同发育期胚体RNA/DNA比率

鱼类的生长跟蛋白质的合成密切相关，而RNA是核糖体的组成成分，DNA含量稳定，能影响细胞的生长率。RNA和DNA在鱼类生长发育过程中有重要作用。大菱鲆胚胎RNA/DNA比率随发育期的变化如图4所示。胚体的RNA/DNA比率从受精卵开始至卵裂期呈现相对平稳的波动，进入囊胚期后，该比值快速增高并在受精后11 h 50 min的低囊期达到最高值14.454；之后，比率急剧降低，在受精后24 h的原肠期达到4.564，在29 h 30 min波动至9.139；此后，该比率保持较低的平稳水平直至65 h。在受精后79 h 35 min，该比率升至7.055；但在103 h的孵化期，该比率降至最低值2.839。根据不同发育时期胚体RNA/DNA比率的平均值得出，RNA/DNA比率由卵裂期(7.523)到囊胚期(10.011)整体呈上升趋势，之后保持下降状态。

图3　不同发育期胚体质量Fig.3　Embryonic body mass during different developmental stages

图4　不同发育期胚体RNA/DNA比率Fig.4　RNA/DNA ratio of embryo during different developmental stages

2.5不同发育期胚体蛋白质/DNA比率

不同发育期胚体蛋白质/DNA比率见图5所示，不同于RNA/DNA的变化趋势，蛋白质/DNA比率比较平稳、变化幅度较小。该比率最小值为43.152，出现在受精后86 h的器官形成期的末期；最大值为58.608，出现在受精后7 h 30 min的128细胞期。根据不同发育时期胚体蛋白质/DNA比率的平均值得出，蛋白质/DNA比率由卵裂期开始呈现“降低—升高—降低—升高”式波动，在卵裂期、囊胚期、原肠期、器官形成期、孵化期，该比率分别为51.867，48.264，50.093，47.520，49.536。蛋白质/DNA比率变化趋势跟RNA/蛋白质类似。

2.6胚体形态性状和胚体质量与生化指标间的关系

以核酸和总蛋白为基础的生化指标跟胚胎长度(ED)、油球直径(OD)、胚体质量(BW)间的关系如表1所示。数据表明，胚胎形态性状和质量跟生化指标间均为“二项式”关系。由关系式系数可看出，RNA/DNA比率是与胚胎形态性状和胚体质量关系密切的生化指标。

3　讨论

本实验中大菱鲆胚体长度经历“缩小—膨大—再缩小—再膨大”的变化过程，胚体形态的变

表1胚体长度(ED)、油球直径(OD)、胚体质量(BW)与RNA/DNA、蛋白质/DNA、RNA/蛋白质间的关系式化趋势跟其内部的细胞运动以及器官发育密切相关[17]。其中，在细胞数量急剧增多的卵裂期和下包运动剧烈的原肠期，胚体均出现缩小的现象，而在其他时期表现为增大的趋势，特别是在发育的最后阶段，胚体膨大明显，分析原因可能是机体通过增大自身体积来吸收外部的水分，以此来提高胚体内的压力，帮助胚体冲破胚膜顺利孵出。胚体发育过程中，油球在卵裂期之后呈现持续下降的状态，说明随着细胞活动和组织分化程度的逐步升高，机体耗能量增大，对油球中脂类和脂肪酸等营养物质的利用比率也逐渐增加。此外，胚体质量随着发育期也呈现不同的变化趋势，最高值发生在原肠期，而最低值则出现在孵化期。

Table 1The relationships among embryonic length (ED)，oil globule diameter (OD)，embryonic body mass (BW) with RNA/DNA，protein/DNA，RNA/protein ratios

关系式R2值ED=2.9963(RNA/DNA)2-57.341RNA/DNA+2065.20.786*OD=0.1318(RNA/DNA)2-4.2301RNA/DNA+349.250.537BW=0.0026(RNA/DNA)2-0.0462RNA/DNA+0.72670.683ED=-0.2062(protein/DNA)2+15.982protein/DNA+1553.50.635OD=-0.0293(protein/DNA)2+3.1291protein/DNA+245.330.315BW=-0.0007(protein/DNA)2+0.0615protein/DNA-0.88880.525ED=-16441(RNA/protein)2+4512.7RNA/pro-tein+1553.50.487OD=-2337.1(RNA/protein)2+883.5RNA/pro-tein+245.330.137BW=-52.164(RNA/protein)2+17.367RNA/protein-0.88880.383

注：*代表相关关系显著(P<0.05)。

图5　不同发育期胚体蛋白质/DNA比率Fig.5　Protein/DNA ratio of embroy during different developmental stages

在生物体内，遗传物质DNA含量是相对稳定的，反映的是机体的细胞数量，而遗传物质RNA的含量则与蛋白质的合成联系紧密[18-19]。由于仔稚鱼的生长依赖于蛋白的合成，再加之以核酸为基础的参数对仔稚鱼的摄食变化反应灵敏，所以核酸和蛋白指标是评价仔稚鱼生长的有效参数[20-21]。目前，DNA，RNA和蛋白指标已经广泛应用于鱼类仔稚鱼和幼鱼生长发育的评价，Park等[22]分析了亚洲油鲽变态前仔稚鱼生长和RNA/DNA比率的变化；Mercaldo-Auen等[23]建立了用RNA/DNA比率来评估隆头鱼生长的关系式；Mercaldo-Allen等[24]研究了冬鲆RNA/DNA与生长的数量关系；Gwack等[25]通过测定饥饿状态和投喂状态下牙鲆的RNA/DNA，建立了用RNA/DNA比率来评价仔稚鱼营养状况的方法。但是，鱼类胚胎期生长发育与核酸和蛋白指标间关系的研究却鲜有报道。本实验中，大菱鲆胚胎发育阶段，胚体RNA/DNA比率平均值的最高值出现在囊胚期，之后保持不同幅度的下降趋势并且在孵化期出现最低值。而蛋白质/DNA比率进入卵裂期之后，经历囊胚期、原肠期、器官形成期、孵化期，不同时期该比率的变化趋势为“降低—升高—降低—升高”。上述核酸和总蛋白指标的变化表明，大菱鲆胚胎进入卵裂期后细胞不断分裂，胚体的生长以细胞增殖为主直至囊胚期；之后的胚体生长以细胞增大为主直至原肠期；胚胎进入原肠期后胚盘中细胞不断下包，胚体的生长以细胞增殖为主直至器官形成期；之后胚体生长以细胞增大为主直至孵出，即：大菱鲆胚体的生长是细胞增殖和细胞增大周期性交替的过程。

本实验中，笔者对胚体长度、油球直径、胚体质量与核酸、总蛋白等生化指标进行了统计分析，建立了相关指标间的关系式。结果显示，胚体形态性状和质量跟生化指标间均为“二项式”关系，而且RNA/DNA比率是与胚胎形态性状和胚体质量关系密切的生化指标。

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(责任编辑卢福庄)

Relationship between embryonic growth and nucleic acids of Scophthalmus maximus

TONG Xue-hong1，2，TANG Xin-hui2，BAO Cheng-man2，YANG Xiao-lan2，CHEN Qian2，TAO Ping2

(1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal Wetland Bioresources and Environmental Protection，Yancheng 224051，China;2.College of Ocean and Biological Engineering，Yancheng Teachers University，Yancheng 224051，China)

Embryonic development of turbot (Scophthalmus maximus) was studied，and the growth characteristics as well as the changes of nucleic acids and proteins were analyzed to establish the relationship between growth traits and biochemical indexes.The major results were as follows:(1) Embryonic length changed according to the tendency of “decrease-enlargement-decrease-enlargement” at different stages，and reached the minimal value of 0.998 mm at 5 h 40 min after fertilization and the maximal value of 1.089 mm at hatching.(2) Diameter of oil globule increased till cleavage stage and decreased thereafter with the appearance of the highest value of 0.192 mm at 9 h 40 min and the lowest value of 0.176 mm at 65 h.(3) Embryonic body mass increased before gastrula stage and decreased thereafter，and presented the minimal value of 0.340 mg at 7 h 30 min and the maximal value of 0.674 mg at 9 h 40 min.(4) The changes of RNA/DNA and protein/DNA ratios showed that embryonic growth was dominantly hyperplastic till blastula stage，hypertrophical till gastrula stage，hyperplastic till segmentation stage and hypertrophical till hatching，indicating that embryonic growth was periodic alternation of hyperplasia and hypertrophy.(5) The relations were binomial among morphological traits，body mass and biochemical indicators，and RNA/DNA ratio was closely correlated with growth traits.

turbot;embryonic development;nucleic acids；RNA/DNA

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):428-434http://www.zjnyxb.cn

佟雪红，汤新慧，鲍成满，等.大菱鲆胚胎生长与核酸关系的研究[J].浙江农业学报，2016，28(3):428-434.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.11

2015-09-22

国家自然科学基金资助项目(31340007)；江苏省盐土生物资源研究重点实验室开放课题(JKLBS2014011)；江苏省高校自然科学基础研究项目(12KJB240001)；国家大学生创新创业训练计划项目(201410324012)；盐城师范学院教授、博士基金项目(6207110006)

佟雪红(1979—)，女，山东潍坊人，博士，讲师，从事鱼类生理学研究。E-mail∶txh113005@163.com。

S965.3

A

1004-1524(2016)03-0428-07