反相高效液相色谱法测定三尖杉中三尖杉酯碱研究

江慧，胡奎，王凡 刘先福，李俊凯

（长江大学农学院，湖北荆州434025）

三尖杉属（Cephalotaxus）是裸子植物中的一个小属，分布于东亚及中南半岛北部，主产于中国，在长江以南各地均有分布，主要分布在云南、海南等地［1］。三尖杉酯碱是我国特产的三尖杉属植物中分离的抗肿瘤生物碱之一［2］，主要用于治疗急性早幼粒细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性粒细胞性白血病及恶性淋巴瘤等，并有较好的治疗效果［3－5］。其用药剂量少，作用原理比较独特，与常用的抗白血病药物无交叉耐药性，在我国已经广泛应用于临床。但是，由于过度开发利用及生存环境的恶化，造成我国的三尖杉植物几近灭绝，现在该树种已经被列为国家野生植物保护品种，资源极其缺乏，而且落后的分离检测技术也限制了三尖杉植物的合理使用［6－7］。

目前，国外有关三尖杉酯碱测定的报道很多，但应用高效液相色谱法检测的却很少［8－10］。因此，建立高效液相色谱法为寻找新的三尖杉植物资源、开发新的三尖杉生物碱提纯分离技术、发现新的有效或可以用作半合成的化合物对深入三尖杉生物碱的研究、提高有限资源的利用率都有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津LC－10Avp高效液相色谱仪及工作站（带UV－Vis检测器及Class－vp色谱工作站），0.22μm微孔过滤器、旋转蒸发仪RE－52（上海亚荣生化仪器厂）。

三尖杉酯碱标准品购自国家标准物质中心；三尖杉植物样品产品由长江大学生命科学院提供；乙酸铵、氨水、酒石酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、无水碳酸钠均为分析纯，甲醇为色谱纯。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

采用ODS－C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；以甲醇∶0.02mol·L－1乙酸铵溶液（体积比48∶52）为流动相，流速1.0ml·min－1，柱温40℃，检测波长296nm，进样量20μl。

1.2.2 标准品溶液配制

精密称取10.00mg三尖杉酯碱标准品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容得0.2mg·ml－1母液。精密量取适量母液，分别用甲醇稀释成含三尖杉酯碱10.0、5.0、2.5、1.0、0.5mg·L－1系列标准溶液，冰箱4℃保存备用。

1.2.3 样品的前处理

称取三尖杉植物样品20.00g，浸泡于80ml甲醇中，水浴回流24h，浸提3次，将浸提液减压蒸干回收甲醇后，用40ml酒石酸（3%）水溶液溶解浸膏，溶液用30ml乙酸乙酯萃取3次，水层用饱和碳酸钠溶液调pH至8左右，然后用30ml氯仿萃取3次，将氯仿萃取液蒸干，用甲醇溶解，定容至2ml，待测［11］。

1.2.4 方法的准确度和精密度测定

设置0.5、1.0、5.0mg·L－13个添加浓度，每个浓度重复3次，再按前述样品处理方法处理后测定添加回收率及相对标准偏差（RSD）。

2 结果与分析

2.1 三尖杉酯碱高效液相色谱分析的色谱图

将三尖杉酯碱标准溶液分别在前述色谱条件下进行测定，以峰面积对浓度进行线性回归，得到回归方程为Y＝3762.7 X－354.96（r＝0.9998），保留时间为29.337min。表明在该色谱条件下，样品峰与杂质峰能较好地分离（图1），可见该方法具有良好的线性相关性。

图1 三尖杉酯碱标准品色谱图

2.2 方法的准确度和精密度

按前述色谱条件进行分析，计算其平均回收率在88.1～95.4%之间，相对标准偏差（RSD）小于3.6%。（表1）。

表1 添加回收率测定结果

2.3 实样检测

三尖杉植物样品按前述方法对其进行测定，结果显示，植物样品被检测出含有三尖杉酯碱，其浓度为4.3mg·L－1，植物样品色谱图如图2所示。该检测结果表明，该方法可以满足对植物样品中的三尖杉酯碱测定的要求。

图2 植物样品色谱图

3 小结

三尖杉酯碱为三尖杉属植物中的一种生物碱，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等有机溶剂。在反相高效液相色谱分析时，流动相中加入少量乙酸铵，有利于改善峰型，防止色谱峰拖尾现象。

本研究建立了反相高效液相色谱－紫外法（HPLC－UV）测定三尖杉植物样品中三尖杉酯碱的方法。在该方法下，样品的回收率稳定，精密度及准确度较好，适用于对三尖杉中三尖杉酯碱的测定。

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［11］朱云霞，侯卫，李明.福建三尖杉中生物碱的高效液相分离与鉴定 ［J］.复旦学报：自然科学版，2004，43（6）：11－24.