地高辛标记探针检测重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白宿主DNA残留量的研究

蔡晓娜，王鹏，贺晓强，刘立平，陈海容，郭晋霞，范开

重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白（recombinant neutrphil inhibitory factor and hirulog hybrid，TNHH）是一种通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白，临床上可用于急性脑栓塞后的脑组织损伤修复，减少脑水肿，防止微小血栓形成从而改善微循环，是一种有前景的心脑血管疾病治疗创新药物，目前已进入临床 I、II 期研究[1-2]。由于在生产过程中使用了工程菌大肠杆菌，而宿主菌的残留 DNA 是重组药物中特有的潜在致癌性杂质，可能会随药物一同进入人体最终致癌，因此对 TNHH 原液中外源性 DNA 残留量的检测极为重要[3]。

目前对重组生物制品的残留宿主 DNA 检测方法有多种[4-6]，与其他方法相比，地高辛标记探针杂交法具有灵敏度高、特异性强、对操作人员无放射危害等优点[7]。本文采用分子杂交法，从小片段基因组 DNA 的制备、纯化、处理、阳性样品的制备等方面进行优化，建立了 TNHH 制备过程中工程菌 DNA 残留的质控方法。

1 材料与方法

1.1 材料

TNHH 工程菌、TNHH 原液由重庆富进生物医药有限公司制备；地高辛标记和检测试剂盒购自美国罗氏公司；正电荷尼龙膜购自美国安玛西亚公司；细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自美国 Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 工程菌基因组 DNA 的制备 按照基因组 DNA提取试剂盒说明制备 TNHH 工程菌基因组 DNA，并通过1% 琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白测定仪测定 DNA 纯度和浓度，并于 –20 ℃ 冻存备用。

1.2.2 模板 DNA 的制备 超声处理基因组 DNA，恒定功率，不同超声次数得到大小不同的 DNA 样品，电泳检测 DNA 片段大小。

1.2.3 探针的制备 取 1 μg 超声处理过的基因组 DNA，加入无菌水至终体积 16 μl，沸水浴 10 min 后，立即冰浴10 min 迅速冷却。取 4 μl 地高辛高效标记引物加入变性DNA 中，混匀后 500×g 离心 20 s。37 ℃ 孵育过夜，加入 2 μl 0.2 mol/L EDTA（pH 8.0）终止反应，置于 –20 ℃ 保存。另一组 EDTA 终止后，加 5 μl 4 mol/L 氯化锂、75 μl 冰乙醇，然后置于 –20 ℃，2 h。15000×g 离心 15 min 后，用 100 μl 70% 的乙醇洗一次，风干后加 50 μl TE 缓冲液复溶上述沉淀即为纯化的探针。

1.2.4 探针标记效率的检测 先将标记好的两组探针和地高辛标记对照探针稀释成 l ng/μl，再分别依次稀释至 10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01 pg/μl，分别取 1 μl 各浓度样品点于尼龙膜上，经固定和封闭后，进行 Anti-DIG-AP 和NBP/BCIP 显色反应。

1.2.5 供试液的制备

1.2.5.1 阳性标准品及供试品溶液、阳性样品的制备

⑴阳性标准 DNA 溶液的制备：用 pH 8.0 的 TE 溶液稀释工程菌基因组 DNA 至 10 ng/μl，然后依次 10 倍稀释为 1 ng/μl、0.1 ng/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、0.1 pg/μl。阴性对照为 TE 溶液。

⑵供试品溶液的制备：取 3 批 TNHH 原液，用 TE 溶液将样品稀释至每 300 μl 含 4 mg TNHH （相当于临床最大剂量）用于点膜。

⑶阳性样品的制备：取供试品 450 μl，加 10 ng/μl 标准 DNA 溶液 1.5 μl，使其中含 1.5 ng标准 DNA，即与阳性标准 1 ng 对比。

1.2.5.2 样品处理

⑴制备的阳性标准、供试品溶液及阳性样品不进行任何处理；

⑵分别按表 1 反应体系进行处理；

表1 样品处理反应体系

⑶按表 1 反应体系进行处理后，DNA 纯化试剂盒进行回收；

⑷按表 1 反应体系进行处理后，酚氯仿抽提法进行回收。

1.2.6 点膜、固定、杂交和免疫检测 将 1.2.5 项下不同处理方法所得阳性标准品系列、供试品、阳性样品、阴性对照品和空白对照品（未经过蛋白酶 K 预处理的 TE 缓冲液）按地高辛标记检测试剂盒说明书进行变性、点膜、固定、杂交、洗膜和免疫检测。显色后，将供试品与阳性标准比较，根据显色深浅判定原液中宿主 DNA 的含量。

2 结果

2.1 工程菌基因组 DNA 含量

工程菌基因组 DNA 的 A260/A280比值为 1.82，微量核酸测定仪测定浓度为 856 ng/μl。电泳结果如图 1 所示，制备的基因组 DNA 完整性较好，纯度较高，符合实验要求。

图1 工程菌基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱

2.2 探针标记效率的检测

2.2.1 超声处理制备小片段 DNA 基因组 DNA 经不同次数超声处理后的电泳结果显示：超声次数越多，基因组DNA 片段越小；超声 2 次得到 100 bp～5 kb 的 DNA 片段；超声 4 次得到 100 bp～1 kp 的 DNA 片段（图 2）。

2.2.2 DNA 片段大小对探针标记效率的影响 制备的探针进行有效性检测，通过比较标记探针和对照探针显色程度，从而确定 DNA 片段大小对标记率的影响。超声多次得到的 DNA 片段标记所得探针（图 3A），只能检测到10 pg 呈显色反应；而超声 2 次所得 DNA 片段标记的探针（图 3B），显色程度和对照探针（图 3C）一致。以下试验中，均选择 2 次超声处理的 DNA 片段作为模板进行探针标记。超声次数过多，会使 DNA 片段过小，探针的标记效率反而更低。

图2 超声处理 DNA 电泳检测图

图3 超声次数对 DNA 标记效率的影响

图4 DNA 片段纯度对标记效率的影响

2.2.3 DNA 片段纯度对探针标记效率的影响 检测结果如图 4 所示，未纯化探针（图 4A）的标记效率明显低于纯化探针（图 4B），纯化处理后的探针能够在 0.3 pg 呈显色反应，而未处理的探针只能检测到 3 pg 的反应点。试验结果显示，选择纯化处理的探针能达到更高的标记效率。

2.3 样品不同处理方法检测结果对比

阳性标准品及供试品溶液、阳性样品经不同方法处理后，用标记好的探针进行杂交，检测 DNA 残留量，检测结果如图 5 所示，表明蛋白酶 K 处理后用 DNA 纯化试剂盒回收的样品检测灵敏度明显提高；加样回收的阳性样品显色均与相应的阳性标准显色相当，证明供试品溶液蛋白并无对 DNA 杂交反应造成干扰，即验证了试验结果的准确性。

2.4 TNHH 原液中外源性 DNA 残留量的检测

图5 样品不同处理方法对检测结果的影响

图6 3 批次 TNHH 原液宿主 DNA 残留量检测图

检测 3 个批次的 TNHH 原液，首先制备阳性标准DNA 梯度溶液，同时制备同系列梯度的阳性样品，即参照1.2.5.1 阳性样品的制备方法；标准及样品经蛋白酶 K 酶切后，用 DNA 纯化试剂盒进行回收处理，然后进行杂交显色。检测结果如图 6 所示，3 批原液正常用剂量的外源性DNA 残留量均小于 10 ng，且阳性样品组（图 6B）与阳性标准组（图 6A）梯度显色结果基本一致，表明供试品溶液自身不干扰其中 DNA 残留量的测定。故 3 批次供试品均符合 2010年版《中国药典》三部中有关工程菌 DNA 残留量的质控要求。

3 讨论

本研究利用地高辛标记工程菌 DNA 片段作探针，通过分子杂交和免疫显色检测重组 TNHH 原液中残余DNA，并优化了实验方案，实验结果证明此方法快速高效、重现性好。基因工程产品残余 DNA 检测受到很多因素影响，因此制备特异性强、灵敏度高的探针及恰当大小的模板已成为关键步骤。通过实验研究发现，地高辛标记探针法测定 DNA 的残留量有着特异性高、操作简便和重现性好的特点，可以用于注射用 TNHH 生产过程中的质量监控，符合国家制定的相关质量控制标准。

利用超声所得 100 bp～5 kb 基因组 DNA 作为模板进行探针标记，并对标记探针纯化处理，供试品、标准品及阳性样品经蛋白酶 K 在 37 ℃ 下酶切作用 4 h，再用DNA 纯化试剂盒进行回收去除干扰蛋白，对杂交膜进行免疫检测后采用底物显色法显色，从而建立了灵敏度为 10 pg的宿主 DNA 残留检测方法。

探针片段的长短、纯度等影响探针标记率的高低进而对检测结果有着至关重要的影响。地高辛进行探针标记是以随机的方式进行的，因此制备探针用的 DNA 片段不宜太长，也不宜太短，实验结果证明基因组 DNA 片段过小，反而会大大降低标记率。在制备好探针后进一步纯化除去蛋白杂质也是必要的，实验证明纯化后标记效率明显提高。

微量残余 DNA 的检测受蛋白质的干扰较大，由于蛋白质含量远远高于残余 DNA，有可能导致假阳性。排除蛋白质对检测的影响至关重要，采用蛋白酶 K 处理的方法，37 ℃ 作用 4 h 后 DNA 纯化试剂盒回收除去大量蛋白质后，再检测残余 DNA，证明试剂盒回收处理效果是最好的。同时设置阳性样品组作为对照，进一步证明实验结果方法是可行的。

综上所述，本文建立的地高辛标记探针检测 TNHH 原液中宿主 DNA 残留量的方法灵敏度高、特异性强、重现性好、操作相对简单且对人体无害，能够满足检测和质控的要求，同时本研究对实验条件优化进行摸索，为那些国内尚无通过药检、无先例的生物制品的宿主 DNA 残留量测定提供参考。

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