尿液蛋白质组学中样品前期处理方法的研究进展

卢海涛，牛超，倪茂巍，朱忠欣，丛维涛，金利泰

尿液是血液经肾小球滤过，肾小管和集合管重吸收、排泻及分泌产生的终末代谢产物，其组成与性状可反映整个泌尿系统的状况。尤其是尿液中蛋白质种类和数量的变化携带有泌尿系统疾病发生、发展及预后的各种信息，而尿液蛋白质组学是诠释尿液蛋白所携带信息的最有效方法之一，而且此研究可以发现体内很多疾病的生物标志，例如膀胱癌和肾炎等。然而尿液中的盐浓度高，代谢废物多，还有很多低浓度的复合物，复杂的组成成分大大增加了尿液蛋白质组学的研究难度[1]。因此，尿液样品的前期处理在尿液蛋白质组学分析和疾病分析过程中是一个相当重要的环节。本文着重阐述近年来国内外尿液蛋白质组学样品的前期处理方法以及各方法的比较。

常用的尿液样品前期处理技术主要包括两种：非浓缩型与浓缩型尿液样品处理。用考马斯亮蓝结合法、Folin 法及凝胶电泳技术检测这两种方法处理的尿液样品，并且利用临床上的肾活检符合率指标来检验其准确度。其中非浓缩尿液样品肾活检符合率约 90.0%；浓缩型尿液样品肾活检符合率约 99.0%。

1 非浓缩型尿液蛋白质组学的样品处理

尿蛋白成分可用于反映肾小球及肾小管损伤的程度。从近几年研究来看，临床检验主要运用肾组织穿刺活检和非浓缩型处理尿液后蛋白检测两种技术。肾组织穿刺活检虽是准确判断肾脏病变的方法，但其创伤性和高风险性限制了其应用，不易被患者接受。而非浓缩型处理尿液后蛋白检测方法因其对患者身体无任何损伤、取材方便、报告快速准确，而且比较全面、客观反映尿中蛋白质的整体情况等优点而被广泛应用，其方法步骤主要是非浓缩处理尿液后进行凝胶电泳检测。姜傥[2]用此方法检测肾炎患者尿液，用磺柳酸作蛋白定性，生理盐水予以稀释后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和十二烷基硫酸钠-琼脂糖凝胶电泳（SDS-AGE），将尿液中的蛋白质在电场作用下按照分子量大小进行分离。分子量 < 70 kD 为肾小管性蛋白尿，主要用来反映肾小管重吸收功能障碍；分子量 = 70 kD 为选择性肾小球性蛋白尿；分子质量 > 70 kD 为非选择性肾小球性蛋白尿，主要用来反映肾小球滤过功能障碍。文献[1]报道，肾组织活检与 SDS-AGE 尿蛋白电泳技术检测的结果进行对比，其符合率高达 94.4%。

2 浓缩型尿液蛋白质组学的样品处理

按照浓缩法处理尿液后的效果可以分为低浓缩型与高浓缩型两种方法[3]，这两种方法各有其特点（表1）。低浓缩型方法是指对尿样进行相对较低程度的处理或经过低浓缩程度设备的过程；高浓缩型则是对尿样进行相当高的浓缩过程，进一步减少尿中微量蛋白的丢失，更加适用于尿样临床肾病检验。这两种方法具有纯化浓缩性能优越、准确性好、操作条件温和、尿中微量蛋白丢失少和肾活检符合率高等优点，但其缺点是操作相对复杂，经济费用较高。

表1 高浓缩型与低浓缩型样品处理方法的比较

2.1 低浓缩型尿液样品处理

对尿液样品进行低浓缩型方法处理的目的是运用简便的操作去除尿液中非蛋白的部分杂质，减少后续处理的负荷，以利于精制、分析等后续工序的进行，最终减少部分杂质的干扰[4]，提高与临床组织活检的符合率。这类型的尿液蛋白处理方法各有其特点（表 2）。

表2 低浓缩型尿液样品处理方法的比较

2.1.1 物理法浓缩 物理法浓缩就是利用温度、压强、分子大小等物理性质对尿样进行前期浓缩处理。易菲等[5]对尿液样品在低温加压超滤系统中浓缩尿微量蛋白质。磁力搅拌（200 r/min），在 N2高压（40000 kg/m2）下使尿液通过滤膜浓缩尿液微量蛋白。在 5 mol/L Tris-缓冲液下透析过夜去盐，再次浓缩后收集，检出限可达 10 μg。

这类方法操作简单、对蛋白活性影响小，对后续操作影响低，但是浓缩尿液效果不佳，准确度较低。

2.1.2 化学法浓缩 化学法浓缩则是利用外加化学试剂来处理尿样。Thongboonkerd 等[6]进行的有机溶剂沉淀法是常用的尿液蛋白富集浓缩方法。从防腐剂（异噻唑啉酮）、尿液解冻温度（37 ℃）、丙酮沉淀时间（过夜）和尿液与丙酮体积比（1∶3）等 4 个方面考察，综合探寻丙酮沉淀法富集蛋白的最佳方法，更好地优化丙酮浓缩尿液样品的方法，检出限可达 5 μg。Sarote 等[7]利用 80% PEG 及 15%(NH4)2SO4组成的双水相体系，从尿液中萃取出尿蛋白。研究了 (NH4)2SO4饱和度、盐析次数、分级盐析对尿蛋白提取率和浓缩度的影响，结果表明，尿蛋白的浓缩度随(NH4)2SO4饱和度的提高而增加，饱和度为 45% 时浓缩度最高，达到 97.98%。该作者还做了 (NH4)2SO4两次盐析，尿液浓缩度提高。二步法盐析尿蛋白的浓缩度是一步法盐析的 122.42%，尿蛋白盐析条件的优化为下游尿蛋白质组学的操作奠定基础，检出限可达 1 μg。

化学法浓缩尿液样品处理方法的优点为灵敏度比物理法浓缩型高，操作较为简便，但是效果仍不太理想，对蛋白活性影响大，容易丢失微量蛋白，故仍需对这类方法进行相关优化实验。

2.2 高浓缩尿液样品处理

高浓缩型尿液样品处理方法因其具有准确度高、可信度高、检出限低、蛋白丢失少和肾活检符合率高等优点广泛运用于尿液蛋白质组学的前期实验中，各种方法的特点如表 3所示。一方面浓缩蛋白可保证强的检测信号，另一方面又能去除大部分非蛋白杂质。但是因为价格贵、操作复杂等缺点，限制该技术广泛运用于临床肾病检验中。

表3 高浓缩型方法的比较[8-10]

2.2.1 固相萃取型浓缩 Al-Musaimi 等[11]采用固相萃取-高效液相色谱的方法对尿液进行浓缩纯化，此方法利用萃取剂对尿液中的蛋白进行选择性吸附，洗脱液富集后以甲醇-乙酸（15∶85，V/V）溶液为流动相，C18为固定相，于280 nm 测定其中的尿蛋白含量。该方法结果表明：尿蛋白在 2.26～145 mg/L 浓度范围内呈良好的线性关系，检出限为 0.45 mg/L，方法的平均加权回收率大于 90%，RSD 小于 4.2%。采用该方法对 80 名健康人尿样进行了前期蛋白处理，并进行蛋白检测，结果为 1.55～6.79 mg/L。后来，Nagaraj 和 Mann[12]利用固相萃取处理尿液样品并进行LC-MS/MS 分析处理泌尿道炎症患者的尿液。其有 4 个主要步骤：提取患者晨尿中段、胰蛋白酶消化、SPE 小管纯化蛋白质以及 LC-MS/MS 分析，成功检测出 TNF、ILs、IFN 等因子，并且检出极其微量的 B 因子。但是该方法对尿液蛋白质具有选择性吸附，难免会有微量蛋白丢失，并且洗脱分离的时间不容易把握。

2.2.2 亲和层析型浓缩 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，可以使待分离的尿液蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并保持较高的活性。Malinowska 等[13]报道，对体内各种蛋白质进行检测，其中具有关于尿液样品蛋白质检测的描述。实验员选取正常尿液、肾病患者的发病期与治疗期的尿液进行检测蛋白质的种类与含量。其中，对尿液样品同位素标记尿液蛋白质后进行 HiTrapr Protein AFF 亲和层析柱纯化的前期处理，然后采集一部分进行免疫沉淀，另一部分进行 MS/MS 测定尿液中蛋白质的相对和绝对含量。这种实验室处理尿液样品的方法十分准确地检测出肾病患者的蛋白种类与含量，指导临床的诊治。但是要处理体积较大的尿液样品，亲和柱层析的效率较低，需要进行相关优化实验。后来发展了亲和超滤法，既保持了尿液蛋白与固定相的亲和性，又对尿液样品进行超滤法处理，这种方法提高了对尿液蛋白质的浓缩度与浓缩效率。Tekea 和 Telefoncub[14]用亲和超滤技术浓缩尿液样品，并提取分离尿液中牛胰磷脂酶A2(PLA2)。这种方法是基于壳聚糖-磷酰乙醇胺的合成树脂为亲和载体，浓缩处理尿样后，将前次浓缩的尿样再次在Ca2+存在条件下进行亲和超滤，最后以 EDTA 为洗脱剂，结果显示该酶被纯化 79 倍，活性回收率为 76.3%。

2.2.3 蛋白芯片型浓缩 蛋白芯片是一种高通量监测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。捕获分子一般都固定在芯片表面，由于配体的高度特异性和与溶液蛋白强结合特性所以被广泛地用作捕获分子。Alkhalaf 等[15]采用的蛋白质芯片-质谱联用（SELDI-TOF-MS）技术是基于蛋白质芯片与尿液蛋白结合牢固的原理进行的。将尿液样品上样到芯片表面，孵育后，送入 TOF-MS 检测。分离到 195 个斑点，而用固相配体处理后的样品则分离到 487 个清晰的斑点，极大地扩大浓缩度，并且减少微量蛋白的丢失，更有可信度。后来，Perši等[16]发展了蛋白质微阵列晶片技术，运用了特异性抗原-抗体结合技术与尿液蛋白质微阵列晶片技术结合来处理并分析慢性肾炎患者尿液，非常准确地检测相关的肾炎疾病。蛋白质微阵列晶片技术是一项与固定在表面的蛋白配体或者某些片段（DNA、RNA、protein、antibody 等）相关的技术。随着研究的深入，发现这项技术的不足之处是没有简单的方法浓缩大体积的尿液，可能在尿液中出现功能性保守的现象，从而导致下游检测灵敏度下降。

2.2.4 免疫磁珠型浓缩 Hall 等[17]运用免疫磁珠分离技术（immuno-magnetic bead-based separation，IMS）处理尿样来建立尿液快速免疫学检测和分离浓缩技术。它是以高均一性的磁性微球为固相载体，表面包被有免疫配基，如抗体等。结果表明前期尿样处理理想，与尿蛋白的结合力更强。把磁珠结合到辅助激光解吸电离基质 MALDI-matrix（如CHCA）中，浓缩倍数大大增加。目前该项技术在尿液蛋白分离及尿液生化检测等方面均取得了较大的进展。

2.2.5 同位素标签型浓缩（ICAT） Weeks[18]对尿液中蛋白质进行二向差异凝胶电泳（2D-DIGE）分离纯化蛋白质，筛选出癌症疾病代谢的相关尿液蛋白质之后进行质谱分析，准确检测出主要的 26 种癌症相关蛋白质。2D-DIGE 方法能够使尿液中的蛋白质经花青素标记其 N 端区域后可以对多个蛋白质样品进行同步化检测和差异分析。这种方法实现了在蛋白质分子水平上对癌症进行实时的临床诊治和临床护理。有两组实验室先后对肾病患者尿液蛋白质检测过程中的蛋白质稳定性的问题提出“稳定同位素标记多肽标准物（stable-isotope-labeled peptide standards，SIS）”的实验方案，在液相层析联用质谱处理肾病患者尿液样品的过程中添加氨基酸 C 端同位素标记物 [13C6,15N2]-Lys（98%）或者[13C6,15N4]-Arg（98%）[19-20]。从实验结果来看，这种实验方案避免尿液中的常量与微量蛋白质的降解，更加全面准确地分析肾病患者代谢的蛋白质种类与含量的情况，进而准确地探究患者患病情况。

3 蛋白质组学检测尿液

利用尿液蛋白质组学检测泌尿道疾病的蛋白质可以探究疾病的病理机制。通过采集正常尿液（作为对照）和各种泌尿道疾病患者的尿液进行蛋白质组的方法处理与分析，获得尿液中蛋白质种类与含量等信息，建立尿液蛋白质图谱，并且结合临床上泌尿道疾病的相关信息，探究疾病的病理机制。

3.1 正常尿液蛋白质图谱

Liu 等[21]对 20 名正常志愿者（10 男、10 女）的晨尿通过液相层析纯化处理后联用 MS/MS 分析，检测到少于5% 的新生多肽或蛋白质，并且检测到男性与女性尿中蛋白质含量差异。另外，也运用 Western blot 的技术检测男性与女性尿液蛋白质种类差异性表达。通过各实验组数据的分析与整理，建立了正常尿液蛋白质组学图谱。

3.2 肾脏移植

Loftheim 等[22]采用尿液蛋白质捕获的蛋白质组学方法并结合质谱仪分析手段，对数十名患者肾脏移植发生的急性排斥反应的尿液代谢物进行处理、检测与分析，从而检测出急性排斥反应中的蛋白质种类，包括类生长因子蛋白质、免疫应答因子等，从而确诊出疾病类型。其方法的疾病符合率高于临床上肾活体检测的诊断。既证实尿液蛋白质可以很好地作为疾病标签分子，也证实尿液样品的前期处理、检测分析等尿液蛋白质组学方法非常有利于与尿液相关疾病的临床诊治。

3.3 常染色显性多囊性肾病

常染色显性多囊性肾病（ADPKD）的患病率占晚期肾炎疾病的 10%。尿液蛋白质组学在 ADPKD患者中的尿液标签蛋白分子的检测具有准确率高的良好优势。运用尿液蛋白质组学的低分子量指纹图谱方法检测 ADPKD 患者尿液蛋白质的含量和蛋白质足迹方法分析 ADPKD 患者尿液蛋白质大分子片段。Bakun 等[23]利用尿液蛋白质组学研究30 名 ADPKD 患者的尿液，结果发现 1400 多个蛋白质，继而通过蛋白足迹分析，确定了 155 个与 ADPKD 患者显著性相关的蛋白质。接下来与体内补体系统联合分析，确定载脂蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、几种生长因子、胶原以及胞外基质补体系统等参与 ADPKD 疾病的形成。

3.4 泌尿道肿瘤

Chen 等[24]利用液相色谱纯化后联用质谱分析二甲基同位素标签的泌尿道肿瘤的终尿蛋白质，检测出 24 种微量肿瘤相关蛋白，如胰岛素样生长因子 II mRNA 结合蛋白（IMP3，一种癌胚蛋白）的含量升高，染色质重塑因子肿瘤相关钙离子信号转导因子 2（TACSTD2）的含量大大增加，以及 ARID1A（一种肾小球癌的抑制蛋白）的含量降低等情况。实验员建立了临床确诊的泌尿道肿瘤与其尿液蛋白质相关联的图谱，并建立某些疾病的致病信号通路。然后，利用已建立的图谱所提供的信息，建立多反应机制来观测患者尿液中蛋白质的变化进而关注治疗药物的代谢情况。

3.5 非侵袭性肾炎

Torres 等[25]通过药物托伐普坦（选择性抗利尿激素 2的拮抗药物）治疗非侵袭性肾炎的机制与尿液蛋白质组学检测尿中蛋白质的方法的结合来研究非侵袭性肾炎的病理机制。通过对尿液样品进行六胜肽处理重塑尿液蛋白质后经抗体亲和柱纯化蛋白，然后同位素标记蛋白质，最后利用MS/MS 联用测定蛋白质种类和含量。在多名非侵袭性肾炎患者中检验出 7 种载脂蛋白以及 TIM、SAA4和 proEGF等 111 种蛋白。进一步验证获悉，载脂蛋白与 TIM 共同诱发非侵袭肾炎症的发生，而 SAA4和 proEGF 使炎症加剧，甚至诱发泌尿道癌症的发生。这整个实验过程充分地证实了尿液蛋白质组学对肾病的病理分析和临床诊治提供重要的信息，并有助于建立临床预防与诊治的方案。

4 结语

尿液蛋白，尤其是低丰度尿液蛋白是良好的生物标志物来源，在疾病的诊断、监测、预后等方面很有价值，有广阔的应用前景[26]。但由于尿液蛋白浓度低和干扰因素多等原因，很多检测手段无法对尿液中的蛋白进行准确检测。目前常规的尿蛋白浓缩法已无法满足飞速发展的尿液蛋白质组学研究。尿液蛋白浓缩方法的开发及优化将是尿液蛋白质组学研究的重点之一。

[1] Marimuthu A, O'Meally RN, Chaerkady R, et al.A comprehensive map of the human urinary proteome.J Proteome Res, 2011, 10(6):2734-2743.

[2] Jiang T.Urine proteins and kidney diseases.Chin J Lab Med, 2002,25(5):312-313.(in Chinese)姜傥.尿液蛋白与肾脏病.中华检验医学杂志, 2002, 25(5):312-313.

[3] Sánchez-Juanes F, Muñiz MC, Raposo C, et al.Unveiling the rat urinary proteome with three complementary proteomics approaches.Electrophoresis, 2013, 34(17):2473-2483.

[4] Liu HC, Liu RH, Ho HO, et al.Development of an information-rich LC-MS/MS database for the analysis of drugs in postmortem specimens.Anal Chem, 2009, 81(21):9002-9011.

[5] Yi F, Lei YX, Feng SM, et al.Enriched collection of urinary microprotein.Chin Occup Med, 2001, 28(4):4-5.(in Chinese)易菲, 雷毅雄, 冯苏妹, 等.尿微量蛋白质的优化收集.中国职业医学, 2001, 28(4):4-5.

[6] Thongboonkerd V, McLeish KR, Arthur JM, et al.Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation.Kidney Int, 2008, 62(4):1461-1469.

[7] Sarote N, Rajni HK, Pawinee K.Purification of papain from Carica papaya latex: Aqueous two-phase extraction versus two-step salt precipitation.Enzyme Microb Tech, 2006, 39(5):1103-1107.

[8] Lambie SM, Schipper LA, Balks MR, et al.Solubilisation of soil carbon following treatment with cow urine under laboratory conditions.Soil Res, 2012, 50(1):50-57.

[9] Frommberger M, Zürbig P, Jantos J, et al.Peptidomic analysis of rat urine using capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry.Proteomics Clin Appl, 2011, 1(7):650-660.

[10] Dayon L, Turck N, Garcí-Berrocoso T, et al.Brain extracellular fluid protein changes in acute nephritis patients.J Proteome Res, 2011,10(3):1043-1051.

[11] Al-Musaimi OI, Fayyad MK, Mishal AK.Novel liquid chromatographic determination of cystatin C in human urine.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2009, 877(8-9):747-750.

[12] Nagaraj N, Mann M.Quantitative analysis of the intra- and inter-individual variability of the normal urinary proteome.J Proteome Res, 2011, 10(2):637-645.

[13] Malinowska A, Kistowski M, Bakun M, et al.Diffprot - software for non-parametric statistical analysis of differential proteomics data.J Proteomics, 2012, 75(13):4062-4073.

[14] Tekea M, Telefoncub A.Purification of bovine pancreatic phospholipase A2 by an affinity ultrafiltration technique.Sep Purif Technol, 2008, 63(3):716-720.

[15] Alkhalaf A, Zürbig P, Bakker SJ, et al.Multicentric validation of proteomic biomarkers in urine specific for diabetic nephropathy.PLoS One, 2010, 5(10):1932-6203.

[16] Perši N, Pleadin J, Vulić A, et al.Determination of ochratoxin A in serum and urine of pigs.World Mycotoxin J, 2012, 5(4):351-356.

[17] Hall DA, Ptacek J, Snyder M.Protein microarray technology.Mech Ageing Dev, 2007, 128(1):161-167.

[18] Weeks ME.Urinary proteome profiling using 2D-DIGE and LC-MS/MS.Methods Mol Biol, 2010, 658:293-309.

[19] Domanski D, Smith DS, Miller CA, et al.High-flow multiplexed MRM-based analysis of proteins in human plasma without depletion or enrichment.Clin Lab Med, 2011, 31(3):371-384.

[20] Parker CE, Domanski D, Percy AJ, et al.Mass spectrometry in high-throughput clinical biomarker assays: multiple reaction monitoring.Top Curr Chem, 2014, 336:117-137.

[21] Liu X, Shao C, Wei L, et al.An individual urinary proteome analysis in normal human beings to define the minimal sample number to represent the normal urinary proteome.Proteome Sci, 2012, 10(1):70.

[22] Loftheim H, Midtvedt K, Hartmann A, et al.Urinary proteomic shotgun approach for identification of potential acute rejection biomarkers in renal transplant recipients.Transplant Res, 2012, 1(1):1-9.

[23] Bakun M, Niemczyk M, Domanski D, et al.Urine proteome of autosomal dominant polycystic kidney disease patients.Clin Proteomics, 2012, 9(1):13.

[24] Chen CL, Lai YF, Tang P, et al.Comparative and targeted proteomic analyses of urinary microparticles from bladder cancer and hernia patients.J Proteome Res, 2012, 11(12):5611-5629.

[25] Torres VE, Meijer E, Bae KT, et al.Rationale and design of the TEMPO (Tolvaptan Efficacy and Safety in Management of Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease and its Outcomes) 3-4 Study.Am J Kidney Dis, 2011, 57(5):692-699.

[26] Sturm T, Leinders-Zufall T, Maček B, et al.Mouse urinary peptides provide a molecular basis for genotype discrimination by nasal sensory neurons.Nat Commun, 2013, 4:1616.