HPLC－MS/MS法检测猪肉中苯并菲啶类生物碱的研究

冯宋岗，曾建国

(湖南农业大学，兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，长沙410128)

博落回(Macleaya cordata(willd.)R.Br)隶属罂粟科，多年生草本植物，广泛分布于我国的湖南等省［1］。血根碱(Sanguinarine，SA)与白屈菜红碱(Chelerythrine，CHE)［2］为其主要活性成分之一。SA和CHE属于季胺苯并菲啶类生物碱(QBAs)，是苄基异喹啉类生物碱中的一类［3－4］，具有抑菌［5－6］、抗炎［7］等效果。在欧洲，博落回提取物(SangrovitⓇ)已作为植物源性饲料添加剂使用多年［8］。在我国，博落回散已成功地被开发为我国第一个二类新中兽药，并作为首个中兽药药物饲料添加剂批准使用，可视为后抗生素时代为解决饲用抗生素替代技术和产品。本研究以饲喂添加博落回散的饲料的猪为研究对象，对其中SA和CHE的药物残留检测前处理条件和质谱条件进行优化，建立了液质联用检测猪肉中SA和CHE药物残留的方法，并为进一步验证博落回散作为药物饲料添加剂使用的安全性研究提供方法借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 甲酸(质谱级，上海安谱科学仪器有限公司);甲醇(色谱纯，Merk，Darmstadt，Germany);盐酸(分析级，国药集团);乙腈(色谱纯，Merk，Darmstadt，Germany);水(Milli－ Q);正己烷(分析级，国药集团)。血根碱对照品(批号:201101，中国药品生物制品检定所)，白屈菜红碱(批号:111718－200501，中国药品生物制品检定所)。博落回散(批号:1303023，湖南美可达生物资源有限公司，规格:血根碱≥1.5%)。猪肉:实验组为以博落回散作饲料添加剂的饲料(每吨添加博落回散40 g)饲喂90 d后屠宰采集;空白对照为不饲喂添加博落回散的猪肉样品。

1.2 仪器 高效液相色谱－串联三重四极杆质谱(HPLC－MS/MS)(美国 Agilent公司，6460型);Milli－Q Advantage A10系统(美国 MILLPORE公司);KQ5200DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);ML204/02型精密天平(梅特勒－托利多(上海)仪器有限公司);涡旋混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;低温高速离心机(Hermle公司);氮吹仪(北京优晟联合科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液制备 对照品称重前在干燥器中干燥，精密称取血根碱、白屈菜红碱各10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容配制得0.1 mg/mL的对照品储备溶液，将储备液甲醇稀释1000倍，制得血根碱和白屈菜红碱均为100 ng/mL，保存于4℃。

1.3.2 供试品溶液制备 精密称取猪肌肉1 g于50 mL的离心管中，加超纯水2 mL，匀浆机匀浆，加入1%盐酸－甲醇(10∶90，V/V)溶液15 mL，涡旋3 min，超声萃取 20 min，10000 r/min冷冻离心10 min，上清液移入另一50 mL的离心管中;沉淀物加10 mL 1%盐酸－甲醇(10∶90，V/V)溶液按上述方法提取，重复两次;将三次提取的上清液合并，加10 mL正己烷脱脂，涡旋2 min，10000 r/min冷冻离心2 min，弃去上层正己烷相，剩余液体在50℃水浴下氮气吹干，加5 mL甲醇复溶，12000 r/min冷冻离心10 min，上清液过0.22 μm 有机膜;待供试液。

1.3.3 液相色谱－质谱联用测定条件 色谱柱:Agilent Poroshell 120 EC C18(2.1 mm ×150 mm，2.7 μm);流动相A 为0.2%甲酸溶液，流动相B 为乙腈;梯度洗脱:0～8 min，28% ～50%B;8～16 min，50% ～28%B;柱温 35 ℃;流速 0.3 mL/min;进样量 2 μL。

离子源:电喷雾离子源(ESI);毛细管电压:4 kV;离子源温度:300℃;EMV:200 V;正离子模式;脱溶剂气和雾化气为高纯氮气，脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:10 L/min;雾化气压力:45 psi;检测方式:多重反应监测(MRM);碰撞能量、定性离子对及定量离子对等参数见表1。

表1 血根碱和白屈菜红碱的色谱保留时间和定性、定量离子参数

2 结果与分析

2.1 线性关系考察和定量限 精密量取100 ng/mL的对照品溶液 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。按照上述1.3.3项，测定 SA和 CHE的峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，以质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，计算回归方程分别为血根碱Y=489.87X － 107.87 ，R2=0.9996 ，白屈菜红碱Y=1101.2X －192.35 ，R2=0.9995 ，结果表明SA 和CHE质量浓度在0.5～50 ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。对标准溶液进行稀释，按照上述1.3.3项对稀释样品进行检测，检测的信号强度S与背景信号强度N的比值，即信噪比，当S/N=10时样品的最低浓度为最低定量限。经测定，本方法SA和CHE的定量限分别为0.01 ng/mL和0.04 ng/mL。

2.2 重复性和精密度 精密称取同一头猪同一部位肌肉6份，按照1.3.2项制备供试品溶液，并按照1.3.3项进行检测分析，计算得到猪肉中SA和CHE的平均含量为4.75 ng/g和2.10 ng/g。相对标准偏差(RSD/%)为11.68%和9.90%，结果表示该方法重复性良好，取供试液一份，按1.3.3项方法连续进样6次，测定峰面积，计算得SA、CHE的平均含量分别为为5.22 ng/g，2.35 ng/g，RSD 分别为2.58%和3.89%，表明仪器的精密度良好。

2.3 方法的专属性 分别设置空白猪肉样品组、空白猪肉样品加SA和CHE对照品组、饲喂添加了博落回散的猪肉样品组。按1.3.2项对三组样品分别制备供试液，并按1.3.3项进行测定。结果如图1、图2、图3、图4所示，通过图可以看出，SA、CHE峰型良好，且在猪肉中无内源性物质的干扰。空白猪肉样品组未发现目标峰，表明该方法的专属性较好。

图1 空白猪肉样品加SA和CHE对照品组色谱图

图2 饲喂添加了博落回散的猪肉样品组色谱图

图3 血根碱的子离子质谱图

图4 白屈菜红碱的子离子质谱图

2.4 回收率测定 在猪肉样品中添加SA、CHE标准溶液，按 1.3.2 项制备供试品溶液，按 1.3.3 项进行检测分析，对猪肉样品进行3个含量水平的加样回收实验(每个加标浓度测3个平行样)，3个含量水平分别为8、10、12 ng/g。结果如表2所示，从表2可以看出，本方法SA的回收率在88.5% ～94.1%之间，平均回收率为91.5%，CHE的回收率在87.9% ～93.4%，平均回收率为 91.3%，表明方法具有较好的准确度。

表2 SA和CHE加标回收率

2.5 样品检测 实验组和空白对照组猪各6头，屠宰取样，每份样品做两个平行，按照1.3.2项制备供试品溶液，按1.3.3项进行检测分析，平行样本取平均值，结果见表3。由表3可以看出，血根碱和白屈菜红碱在6头猪的肌肉中的平均残留量为4.76 ng/g和 2.09 ng/g。

表3 猪肌肉中SA、CHE残留量检测结果 ng/g

3 讨论与小结

近年来，食源性动物产品的食品安全问题已成为社会的一个焦点问题，药物使用过程中违禁或超规定剂量使用药物，及添加未标示药物成分等违规添加和滥用的现象越来越严重。中兽药作为近几年发展起来的全新方向，其有效活性成分也主要是植物次生代谢产物如生物碱、黄酮等，因此，对其在动物体内的残留进行前瞻性的深入研究，进一步诠释其作为饲料添加剂的安全性很有必要。

因血根碱本身带正电荷对质谱离子源有一定的污染，研究过程中，发现空白样品有时也有极低的阳性响应，因此需要每次检测前进空白溶剂，验证仪器系统没有被污染，每次检测结束后，对离子源进行仔细清理。本研究对样品前处理条件进行了系统优化，发现1%盐酸－甲醇(10∶90，V/V)的提取和沉淀蛋白效果最好，重复三次的提取能够很大程度的提高加样回收率。

本实验以SA和CHE为测试对象，通过对样品前处理条件及HPLC－MS/MS检测条件的优化，建立了猪肉中QBAs残留量的液质联用检测方法。该方法具有前处理较为简单、经济，灵敏度及定量准确高和专属性强等特点，方法学验证的各项指标均可达到实际样品的检测要求，可用于猪肉中痕量QBAs的残留检测。

［1］ 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1999:78.

［2］ 孙丽艳，魏雄辉，韦 宇.博落回总生物碱提取方法的研究［J］.药物分析杂志，2003，23(1):15－18.

［3］ Pavel Kosina，Daniela Walterova，Jitka Ulrichovaet，et al.Sanguinarine and chelerythrine:assessment of safety on pigs in ninety days feeding experiment［J］.Food ＆ Chemical Toxicology，2004，42(1):85 －91.

［4］ Kosina P，Pavel Kosina，Jan Vacek，et al.Identification of benzo［c］phenanthridine metabolites in human hepatocytes by liquid chromatography with electrospray ion－trap and quadrupole time－ of－ flight mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2011，879(15/16):1077－1085.

［5］ 赵东亮，郁建平，周晓秋，等.博落回生物碱的抑菌作用研究［J］.食品科学，2005，26(1):45 －47.

［6］ 徐 丽，曾建国，程 辟，等.血根碱－黄芩苷、白屈菜红碱－黄芩苷离子对化合物体外抗菌活性和急性毒性研究［J］.中南药学，2012，1:4.

［7］ Steven E Newman，Michael J Roll.A Naturally Occurring Compound for Controlling Powdery Mildew of Greenhouse Roses［J］.Hort Science，1999，34(4):686 －689.

［8］ Franz C，Bauer R，Tedesco D，et al.CFT/EFSA/FEEDAP/2005/.2005.01:P.140 －152［S］.