HPLC法测定复方多聚甲醛粉中水杨酸和苯甲酸

罗成江，林仙军，周志强，周芷锦，应永飞

(浙江省兽药饲料监察所，杭州310020)

复方多聚甲醛粉由多聚甲醛、苯甲酸与水杨酸按照3∶1∶1的比例配制而成，用于蚕室、蚕具消毒。农业部公告第1435号关于复方多聚甲醛粉中水杨酸和苯甲酸的检测方法采用紫外分光光度法和容量法［1］，此方法操作过程繁琐，计算较为复杂。因此，研究并建立一种高效、准确的高效液相色谱法测定复方多聚甲醛粉中水杨酸和苯甲酸的含量具有重要意义。目前关于高效液相色谱法同时测定其他制剂中水杨酸和苯甲酸的含量已有报道［2－4］。本文按照《兽药质量标准分析方法验证指导原则》在对色谱条件、专属性、线性关系、稳定性、重复性等方面进行考察后［5］，建立了高效液相色谱法同时测定复方多聚甲醛粉中水杨酸和苯甲酸含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1260系列高效液相色谱仪，配紫外检测器;AG－285电子天平(Mettler公司);KQ－500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);TU－1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1.2 试药与试剂 水杨酸对照品来源为中国食品药品检定研究院，批号为100106－201104，含量为99.9%;苯甲酸对照品来源为中国药品生物制品检定所，批号为100419－200301，含量为100.0%;水为超纯水;甲醇为色谱纯;乙醇及其他试剂均为分析纯。

1.3 高效液相色谱条件 采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，以 0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(取6.8 g磷酸二氢钾，加水900 mL溶解后，用磷酸调节pH值至6.0，加水定容至1000 mL)－甲醇(90∶10)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温40℃，进样量10 μL。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品储备液的制备 取水杨酸对照品和苯甲酸对照品各约20 mg，精密称定，置同一100 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并稀释至刻度，制成每毫升含水杨酸和苯甲酸约为200 μg的溶液，作为对照品储备液。

1.4.2 对照品溶液的制备 精密量取适量对照品储备液，用流动相稀释制成水杨酸和苯甲酸浓度均为20.0 μg/mL的对照品溶液。

1.4.3 供试品溶液的制备 精密称取复方多聚甲醛粉样品0.2 g(约相当于水杨酸和苯甲酸各40 mg)，置200 mL量瓶中，加50%乙醇80 mL，超声提取10 min，放至室温后用50%乙醇溶液稀释至刻度，滤过，精密量取续滤液5 mL，置50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2 结果

2.1 专属性考察 按上述色谱条件，分别对对照品溶液、样品溶液和空白溶液进行分析比对(结果见图1、图2、图3)，以确定是否对水杨酸和苯甲酸峰有影响。结果表明:空白溶液中无水杨酸和苯甲酸吸收峰，对照品溶液和样品溶液中水杨酸峰和苯甲酸峰分离度最小为4.9，符合要求。

图1 水杨酸和苯甲酸对照品溶液的高效液相色谱图

图2 供试品溶液的高效液相色谱图

图3 空白(多聚甲醛)溶液的高效液相色谱图

2.2 回收率试验 取配制复方多聚甲醛粉用多聚甲醛为空白样品，称取适量的水杨酸和苯甲酸对照品添加到已准确称量的空白样品中，混合均匀，作为添加样品，进行加样回收率试验，以考察方法的准确度。回收率结果见表1和表2，从回收率结果可以看出水杨酸平均回收率为99.06% ～99.69%，RSD为0.09% ～0.63%;苯甲酸平均回收率为99.12% ～99.73%，RSD 为0.16% ～0.48%。

表1 复方多聚甲醛粉中水杨酸的添加回收率 (n=3)

表2 复方多聚甲醛粉中苯甲酸的添加回收率 (n=3)

2.3 线性关系考察 分别精密量取适量的标准储备液，用流动相稀释成水杨酸和苯甲酸浓度均为1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL 的标准系列工作液，按上述色谱条件分析，分别以峰面积对进样浓度进行回归，求得回归方程。水杨酸回归方程为Y＝ 1.1 × 105X+12559，在1.0 ～50 μg/mL 范围内线性关系良好，相关系数为0.9999;苯甲酸线性回归方程为 Y ＝ 1.0 ×105X+13627，在1.0～50 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9999。

2.4 精密度试验 取水杨酸和苯甲酸混合对照品溶液(20 μg/mL)，按上述色谱条件重复连续进样6次，测定峰面积，水杨酸和苯甲酸峰面积的RSD分别为0.55%和0.20%，表明此方法的仪器精密度符合要求。

2.5 稳定性试验 对供试品溶液分别于0、2、4、6、12、24 h进样，记录峰面积，计算RSD分别为0.75%和0.17%，表明该方法24 h内稳定性良好。

2.6 重复性实验 取适量水杨酸和苯甲酸对照品分别配制成相当于水杨酸和苯甲酸测试浓度的80%、100%、120%的供试品溶液，每种浓度做3个平行，水杨酸和苯甲酸 RSD分别为 0.56%、0.43%、0.64% 和 0.65%、0.62%、0.82%，表明该方法重复性良好。

2.7 样品测定 取3批复方多聚甲醛粉样品(产地:湖州天健兽药有限公司;批号:20130318、20130319、20130320)制成供试品溶液，每个批次做5个平行，进样分析，记录峰面积，按外标法计算水杨酸与苯甲酸的含量，结果见表3。

表3 样品中水杨酸与苯甲酸的含量测定

3 讨论与小结

3.1 检测波长的选择 为了确定最佳检测波长，采用紫外分光光度法对最佳检测波长进行了考察。用50%乙醇溶液溶解水杨酸和苯甲酸，并稀释至7 μg/mL，参照紫外可见分光光度法，在200～400 nm的波长范围进行扫描，水杨酸在230 nm和302 nm的波长处有最大吸收，苯甲酸在227 nm和272 nm波长处有最大吸收。因此，本实验综合考虑选择230 nm作为检测波长。

3.2 提取溶剂的选择 水杨酸和苯甲酸均易溶于乙醇，因此选用50%乙醇作为前处理提取溶剂，直接用50%乙醇定容上机，峰形不佳，故第二步改用流动相定容上机。

3.3 液相色谱分离条件的确定 本研究对Waters Symmetry C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱、Waters Atlantis C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱、Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱等三种规格的色谱柱进行了比较，结果表明分离结果均较为满意。在流动相选择上，比较了磷酸盐缓冲液/甲醇、磷酸溶液/甲醇和水/甲醇体系的色谱保留性能和灵敏度，结果发现磷酸盐缓冲液/甲醇流动相体系水杨酸和苯甲酸峰型最好、灵敏度最高。进一步优化磷酸盐缓冲液浓度和流动相配比，使水杨酸和苯甲酸获得最佳峰型和保留时间，最终确定流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH 6.0)－甲醇(90∶10，V∶V)，流速为1.0 mL/min。

兽药国家标准汇编(第一册)关于复方多聚甲醛粉中水杨酸和苯甲酸含量的检测方法采用的是紫外－可见分光光度法和滴定法，本文在对色谱条件、线性关系、稳定性、重复性等方面进行考察后，建立了高效液相色谱法。实验结果表明，该方法操作简便、结果准确、稳定性好，能有效检测复方多聚甲醛粉中水杨酸和苯甲酸含量。

［1］农业部兽药评审中心.农业部公告第1435号.兽药国家标准汇编(第一册)［S］.

［2］余小平，舒金富，黄 华，等.HPLC法同时测定华佗膏中水杨酸苯甲酸的含量［J］.中国药品标准，2010，5(11):375 －377.

［3］张 京，闫 荟，费 嘉，等.HPLC法测定复方选净散中水杨酸和苯甲酸的含量［J］.药品检验，2012，7(19):115 －146.

［4］黄 洁，李峰武，刘鹏鸣，等.反相高效液相色谱法测定复方水杨酸酊中水杨酸和苯甲酸含量［J］.中国药业，2012，21(20):39－40.

［5］中国兽药典委员会.中国兽药典二○一○年版一部［S］.