UPLC－MS/MS法检测动物性食品中肝脏、肾脏组织氯霉素残留量

薄永恒，高迎春，陈 玲，陆庆泉，张呈军，魏秀丽

(1.山东省兽药质量检验所，济南250022;2.山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南250022)

氯霉素由Ehrlich等在1947年从委内瑞拉链丝菌的培养液中提取获得，现在基本使用化学合成法大量生产，已广泛用于动物各种传染性疾病的治疗，对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用。由于氯霉素还可与人体线粒体的70S结合，因而也可抑制人体线粒体的蛋白合成，对人体产生毒性。氯霉素在动物性食品中的残留对人类健康可以造成严重危害，主要表现在以下几个方面［1］:(1)引起骨髓造血机能紊乱;(2)对早产儿和新生儿产生蓄积毒性;(3)引起胃肠道症状及口部炎症;(4)其他不良反应可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠，有时发生中毒性精神病。基于以上危害，世界各国都对其做出了严格规定，严禁氯霉素在食源性动物上使用，欧盟规定动物源食品中氯霉素残留的最低要求执行限(MRPL)为0.3 μg/kg。我国农业部235号公告中把氯霉素列为禁用药物［2］。

资料显示［3－4］，氯霉素在动物的肌肉组织中主要以原形药代谢，而在肝脏、肾脏多以氯霉素(CAP)、氯霉素葡萄糖酸苷(CAPG)和Hyocroxyam－酰胺醇类(HAP)及葡萄糖酸苷结合物等形式代谢。虽然已有相关氯霉素残留检测的国家标准以及其他行业标准，但由于农业行业标准的781号公告－2－2006的检测动物组织项目不足，特别是基于氯霉素在肝脏、肾脏代谢规律的以上新研究发现，本项目组根据农业部农业行业标准制定与修订［(2013)91］的要求制定了氯霉素残留在动物肝脏、肾脏的LC－MS/MS检测方法，检测方法快速、准确，可以满足大批量样品高灵敏测定，以期为食品安全检测提供可靠的确证检测方法。

1 材料和方法

1.1 仪器 Acquity UPLC－Quattro Premier XETM质谱联用仪，Waters公司;Acquity UPLC BEH C18色谱柱(500mg/3cc)，Waters公司;AE260电子天平，Mettler Toledo公司;SIR4漩涡混合器，IKA公司;HY－4调速多用振荡器，台式高速冷冻离心机(贝克曼公司)。

1.2 试剂 氯霉素对照品:含量≥98%(Dr.Ehrenstorfer公司);氯霉素－D5对照品:含量≥98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);β －葡萄糖醛酸苷酶，德国默克;甲醇、乙酸乙酯、正己烷为色谱纯(Fisher公司);氨水为分析纯;乙酸钠为分析纯;实验用水均为超纯水。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 氯霉素标准储备液 称取10 mg氯霉素对照品，用甲醇溶解定容至100 mL，溶液浓度为100 μg/mL，－20 ℃保存，有效期1年。

1.3.2 氯霉素－D5标准储备液 称取10 mg氯霉素－D5对照品，用甲醇溶解定容至100 mL，溶液浓度为100 μg/mL，－20℃以下保存，有效期1年。

1.3.3 标准工作液 用流动相稀释适量储备液，氯霉素浓度为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL 的系列标准溶液，其中内标氘代氯霉素浓度为5 ng/mL。

1.4 实验方法

1.4.1 UPLC－MS/MS 分析条件［5］Acquity UPLC BEH C18色谱柱，流动相A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱条件:0～3.5 min，10%A线性变化至90%;3.5～ 4.5 min，90%A线性变化至10%;4.5 ～6 min，维持 10%A。流速为 0.3 mL/min，柱温为30℃，进样量为10 μL。

电离电压为3.1 kV;源温为110℃;雾化温度为400℃;锥孔气流速为50 L/h;雾化气流速为650 L/h;多反应监测(MRM)模式采集。确定各母离子大小的氯霉素与内标的扫描图如图1所示。氯霉素的定性、定量离子对及内标氘代氯霉素离子对、离子源、锥孔电压和碰撞能量如表1所示。

图1 氯霉素与内标的扫描图

表1 氯霉素特征离子参考质谱条件

1.4.2 样品前处理

1.4.2.1 提取 准确称取(5±0.5)g均质样品，加入 20 mL 乙酸钠缓冲液(10 mmol/L)，300 μL β－葡萄糖醛酸苷酶，于37℃温育过夜17 h。酶解样品中加入250 μL氯霉素－D5标准工作液，加入15 mL乙酸乙酯，充分涡旋混匀，中速水平震荡10 min，7000 r/min离心5 min，取上层有机层，旋蒸近干。依次加入正己烷、水各4.0 mL，充分涡旋，40℃水浴中静置5 min分层，取水层备用。

1.4.2.2 净化 取 C18固相萃取柱5 mL甲醇、5 mL水分别预洗，取备用液过柱，弃去流出液，用5 mL 20%甲醇水洗涤，抽干，5 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，取上清液于50℃下氮气吹干，加1 mL 20%甲醇水溶液溶解，过0.22 μm微孔滤膜，上机测试。

1.4.3 标准曲线的绘制 准确量取氯霉素和氯霉素－D5的标准工作液适量，用流动相稀释，配制成氯霉素浓度为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL，氯霉素－D5作为内标浓度为5 ng/mL，供液相色谱－串联质谱测定，以标准溶液中被测组分峰面积与氯霉素－D5峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中相应氯霉素浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

1.4.4 灵敏度 在空白牛、羊、猪、鸡的肝脏、肾脏匀浆组织中分别添加氯霉素及氯霉素－D5标准溶液，分别制成0.1、0.2 μg/kg 的2 个空白添加样品，其中内标氘代氯霉素浓度为1 μg/kg，按确定的提取净化方法处理后，经UPLC－MS/MS检测，观察氯霉素色谱峰信噪比和对应的药物浓度，确定其检测限和定量限。

1.4.5 准确度与精密度 采用标准添加法，在牛、羊、猪、鸡的肝脏、肾脏的匀浆组织中添加3个不同浓度的氯霉素及氯霉素－D5进行回收率试验。各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差。

2 结果

2.1 标准曲线 氯霉素浓度在0.5～10.0 ng/mL范围内，色谱峰面积有良好的线性关系，标准曲线见图2。

图2 氯霉素溶液的标准曲线

2.2 方法灵敏度 牛、羊、猪、鸡的肝脏、肾脏的匀浆组织按上述方法进行处理，氯霉素添加浓度为0.1 μg/kg 时，信噪比(S/N)均 ＞3，确定为方法的检测限，氯霉素添加浓度为0.2 μg/kg时，信噪比(S/N)均＞10，确定为方法的最低定量限。其中猪肝空白组织中添加0.2 μg/kg氯霉素及相应的空白组织的离子色谱图，见图3～图4。氯霉素标准品溶液色谱见图5。

图3 猪肝空白试样离子质量色谱图

图4 猪肝空白添加氯霉素离子质量色谱图(0.2 μg/kg)

图5 氯霉素标准溶液离子质量色谱图(1 ng/mL)

2.3 方法准确度与精密度 各空白组织中在0.2、0.4、2 μg/kg 3 个不同添加浓度的氯霉素，其中内标为1 μg/kg，进行添加回收率试验，回收率为70% ～120%;本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%，准确度和精密度均能满足有关法规的要求。其中猪肝中添加氯霉素的实验结果见表2。

表2 各组织中添加氯霉素的批内平均回收率、批内相对标准偏差及批间相对标准偏差

3 讨论与小结

3.1 样品前处理条件的优化 1994年Heitzman通过饲喂实验发现氯霉素在动物体内的代谢消除存在很大差异，其代谢的共同点是肌肉组织中原形药物最多，在牛和禽的肝脏组织中药物的主要残留形式是氯霉素(CAP)、氯霉素葡萄糖酸苷(CAPG)和Hyocroxyam－phenicol(HAP)，猪的肾脏中多以葡萄糖酸苷结合物的形式存在［3］。因此，在提取肝脏、肾脏组织中的氯霉素时，考虑其葡萄糖酸苷结合物的存在，因此样品加入了β－葡萄糖醛酸苷酶，以酶解其形成原形药再做提取，从而使得检测结果更加接近真值。提取时采取乙酸乙酯提取，20%甲醇水饱和正己烷液液萃取净化的肉样提取方法，也可以提取到氯霉素，但是由于肝肾细胞组织提取裂解后，很多细胞成分不能有效去除，而降低了色谱柱的柱效，减少了有效使用时间，甚至直接堵塞色谱柱，因此使用C18固相萃取柱净化是必要的。

3.2 色谱方法的优化 实验中使用了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm × 50 mm)色谱柱，分别使用了甲醇/水和乙腈/水系统作为流动相进行优化，发现甲醇/水液能得到良好的峰形，且具有更高的质谱响应，与已有报道的乙腈/水为流动相不同［6－8］。同时为了使基质中杂质在色谱柱中充分洗脱，在5 min的洗脱基础上，增加至6 min一个样品。

3.3 质谱方法优化 通过单针将一定浓度的氯霉素及氯霉素－D5注入离子源，在负离子检测方式下进行一级质谱分析、二级质谱分析，得到母离子及子离子信息，然后对锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，对离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量等进行优化，使样液中的离子化效率达到最佳。

本方法检测猪、牛、羊、鸡肝脏、肾脏试料中残留的氯霉素含量，用β－葡萄糖醛酸苷酶酶解后乙酸乙酯提取，C18固相萃取柱净化，液相色谱－串联质谱负离子模式测定，内标法定量，成功建立了动物性食品的肝脏、肾脏组织中氯霉素的残留检测方法。氯霉素的检测限为 0.1 μg/kg，最低定量限为0.2 μg/kg。整个实验过程简单、快速，回收率较高，适合样品动物性食品中氯霉素残留的定量检测。

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