高效液相色谱法测定板蓝根注射液中(R，S)－告依春的含量

韩 立，班付国，周红霞，王 林，刘素梅，张跃京

(1.河南省兽药监察所，郑州450008;2.河南省康星药业股份有限公司，郑州451464)

板蓝根注射液为十字花科植物菘蓝(Isatis Indigotica Fort.)的干燥根，以水提醇沉法提取后制成的灭菌水溶液。作为一种清热解毒、凉血利咽的中兽药注射液，它具有抗菌、抗病毒、抗内毒素、增强免疫的作用，尤其在抗病毒方面疗效确切［1－2］，用于治疗家畜流感、仔猪白痢、肺炎及某些发热性疾病。板蓝根注射液的成分复杂多样，主要有靛蓝、靛玉红、(R，S)－告依春、多种有机酸、核苷、氨基酸等多种成分［3－4］。以往报道的含量测定方法多为测定板蓝根注射液中靛蓝、靛玉红、有机酸、氨基酸的含量［5－7］，但该制剂为水煎提取液，靛蓝、靛玉红为脂溶性，在水提液中溶解性小，因此难以作为含量控制指标。(R，S)－告依春为主要抗病毒活性成分，又为水溶性，因此有必要建立板蓝根注射液中(R，S)－告依春的含量测定方法，用以控制板蓝根注射液的含量。

1 仪器与试剂

Waters超高效液相色谱仪(美国Waters公司)配置TUV紫外检测器检测器，Empower2色谱工作站采集数据。电子天平(BP211D)，德国Sartorius公司。超纯水装置，Milli－Q Advantage A10，美国密理博公司。

甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，中性氧化铝(层析用)，纯化水，(R，S)－告依春对照品(含量99.9%，批号110713－200911，中国药品生物制品检定所)。板蓝根注射液样品6批(批号分别为20130701， 20130702， 20130703， 20130501，20130502，20130503，均由 1家兽药生产企业提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 流动相为甲醇－0.02%磷酸溶液(7:93);色谱柱:Waters XBridge C18，150 mm ×4.6 mm，5 μm;检测波长 245 nm;流速1.0 mL/min;进样量:10 μL;柱温30 ℃。理论板数按R，S－告依春峰计算不低于2400，主峰的保留时间约为12 min。结果见图1、图2。结果表明在上述色谱条件下板蓝根注射液分离效果好，R，S－告依春和其他组分达到基线分离。

图1 对照品色谱图

图2 板蓝根注射液色谱图

2.2 对照品溶液的制备 精密称取(R，S)－告依春对照品10.36 mg，置250 mL量瓶中，加甲醇制成每 mL 含41.4 μg 的溶液，过 0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取板蓝根注射液5 mL，过中性氧化铝柱(内径为1.5 cm，5 g)，收集流出液，再用15 mL水洗脱，流出液和洗脱液合并至25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察 取R，S－告依春对照品溶液，分别稀释成 1、5、10、20、40 μg/mL，精密量取10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，回归方程为:y ＝ 77327x+519.2，相关系数 r＝ 0.9998，在1～40μg/mL的浓度范围内，对照品具有良好的线性关系(图3)。

图3 R，S-告依春标准曲线图

2.5 精密度试验 精密吸取(R，S)－告依春对照溶液10 μL注入色谱仪，记录色谱图，连续进样6次测定峰面积。结果相对标准偏差(RSD)为0.31%，表明系统精密度符合要求。

2.6 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别在样品处理后的 0，1，2，8，12 h 进样，测定峰面积，考察样品稳定性。结果在12 h内含量下降率仅为0.13%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验 取批号为20130701的板蓝根注射液，精密量取5 mL，共6份，分别按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件进样测定，计算含量及RSD。结果样品中(R，S)－告依春的含量为 37.8 μg/mL，RSD 为 0.03%，表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验 取批号为20130701的板蓝根注射液，精密量取2.5 mL，共6份，用移液枪分别加入0.4 mg/mL标准贮备液0.236 mL(相当于约94.5 μg的(R，S)－告依春)，按照 2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件测定，计算平均回收率及RSD，结果见表1。结果表明，该方法平均回收率为98.6%，RSD为0.36%，说明方法的回收率较高，重复性良好。

2.9 样品的测定 取同一公司5批板蓝根注射液样品，每批量取两份，按供试品处理方法处理。取10 μL样品溶液注入色谱仪，记录色谱图，平行进样两次，计算平均含量。各批次样品的含量见表2。结果表明5批板蓝根注射液含板蓝根以(R，S)－告依春计，在36.2 ～42.5 μg/mL 之间。

表1 (R，S)-告依春回收率试验结果

表2 样品测定结果

3 讨论与小结

3.1 样品提取方法的选择 板蓝根注射液为板蓝根水浸出物的灭菌水溶液，主要工艺为加水煎煮，浓缩，醇沉之后加水定容，每1 mL相当于0.5 g原生药。(R，S)－告依春溶于三氯甲烷、乙醇、甲醇，也能溶于沸水，不溶于冷水。试验分别比较了甲醇、70%甲醇、30%甲醇、纯水作为溶剂进行稀释提取。结果发现室温条件下(20～25℃)用纯水提取的回收率最高，而用10℃以下的冷水提取时回收率有明显下降，这与石燕红［8］的结论相符。因此，试验选用纯水在室温条件下提取。考虑到(R，S)－告依春在冷水中溶解度很小，应尽量避免使用冷水提取。

3.2 样品的净化 试验比较了样品过中性氧化铝柱和不过中性氧化铝柱的效果。发现不过中性氧化铝柱时，供试品溶液颜色较深，进样后杂质峰较多，很难与目的峰分离。当样品过中性氧化铝柱后，供试品溶液颜色变浅，杂质峰明显减少，样品的含量几乎没有变化。可以推断，色素等杂质被中性氧化铝吸附，但(R，S)－告依春基本都被洗脱下来。

3.3 样品的含量 试验考察了同一公司6批样品，(R，S)－ 告依春含量范围为 36.2 ～42.5 μg/mL。由于药材来源不同，不同公司的生产工艺存在差异，板蓝根注射液中(R，S)－告依春含量相差可能较大［9］。参照《中华人民共和国药典》板蓝根和《兽药国家标准》(化学药品、中药卷)板蓝根注射液有关标准［10－11］，有必要对板蓝根注射液成品中(R，S)－告依春的收率以及不同来源的板蓝根注射液中(R，S)－告依春含量进行进一步的测定和考察，以制定出合理的含量限度。

3.4 方法的评价 现有文献报道了几种不同的高效液相色谱流动相条件对(R，S)－告依春进行含量测定，主要包括乙腈－磷酸水系统［12］、乙腈－冰乙酸水系统［13］等流动相系统，试验对这几种方法分别进行了考察，发现采用甲醇－0.02%磷酸水溶液(7∶93)流动相系统效果最好，方法学考察均符合要求。

3.5 小结 试验建立了板蓝根注射液中(R，S)－告依春含量测定的高效液相色谱方法。该方法简单快速，灵敏度高，重复性好，可以有效控制板蓝根注射液中(R，S)－告依春的含量，并为板蓝根注射液的质量标准修订提供参考。

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