气相色谱法检测沙咪珠利中的残留溶剂

王昊欣，王霄旸，张丽芳，郑文丽，费陈忠，张可煜，王 米，李 涛，王春梅，肖 遂，薛飞群

(中国农业科学院上海兽医研究所，中国农业科学院兽药安全评价与残留研究重点开放实验室，农业部动物寄生虫学重点开放实验室动物药学研究室，上海200241)

球虫病是危害养禽业的重大原虫病，目前球虫病的防治主要依赖于三嗪类、磺胺类等抗球虫药物［1］。然而，当前临床上球虫耐药性普遍，防治效果越来越低下，亟需安全、高效、无交叉耐药的新型抗球虫药物以应对这一局面［2－3］。沙咪珠利是一种新型三嗪类抗球虫药，是由中国农业科学院上海兽医研究所动物药学研究室自主研发的新型抗球虫化合物。已有研究结果显示沙咪珠利不仅具有良好的抗球虫效果(抗球虫指数 ACI达185～200)，且无致畸、致癌、致突变作用，具有良好的应用前景，可能成为一种新型抗球虫药物。依据《中华人民共和国兽药典》规定，残留溶剂检测须对合成工艺中使用的全部第二类溶剂和终产品精制过程中使用的第三类溶剂进行研究。在合成沙咪珠利的工艺中，使用了第二类溶剂甲醇和甲苯;精制时使用了第三类溶剂乙醇，因此本文建立了这三种有机溶剂的气相色谱法检测其残留含量［4－5］。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent 7890A气相色谱仪，带FID检测器(美国Agilent公司);DB－WAX(30 m×0.25 mm × 0.25 μm)色谱柱(美国 Agilent公司);Mettler Toledo XP504分析天平(梅特勒－托利多公司);甲醇、乙醇、甲苯、二氧六环和N，N－二甲基甲酰胺均为分析纯。

1.2 标准品和样品 沙咪珠利对照品(批号:20130429)及原料药(批号:20130304、20130308、20130411)为本实验室合成。

1.3 溶液配制

1.3.1 内标溶液 精密称量154.9 mg二氧六环，置于50 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，摇匀，即得。

1.3.2 供试品溶液 精密称取沙咪珠利原料药0.1 g，加入1 mL内标溶液，置于10 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，摇匀，即得。

1.3.3 对照品溶液 精密称量31.68 mg甲醇，47.4 mg乙醇，8.67 mg甲苯，置于50 mL 容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，摇匀;精密量取该溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加1 mL内标溶液，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。其中甲醇、乙醇和甲苯的含量分别为 316.8、474 和 86.7 μg/mL。

1.4 检测方法

1.4.1 色谱条件 DB－WAX(30 m ×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱;进样口温度180℃，分流比50:1;程序升温，初始柱温60℃，保持4 min，50℃/min升至80℃，保持1 min，再以100℃/min升至200℃，保持4 min;载气为氮气，柱流速1.0 mL/min;检测器为FID，检测器温度200℃，氢气流速30 mL/min，空气流速 300 mL/min;进样量 1.0 μL。

1.4.2 测定方法 精密量取供试品溶液1.0 μL，按照上述气相色谱法采用溶液直接进样，记录色谱图，计算各待测物与内标物的峰面积比，以标准曲线定量测定。甲醇含量不得超过0.3%，乙醇的含量不得超过 0.5%，甲苯的含量不得超过0.089%［5］。

1.5 方法学验证

1.5.1 系统适用性试验 根据《中华人民共和国兽药典》残留溶剂测定要求，进行系统适用性试验［5］。取 N，N －二甲基甲酰胺溶剂进样 1.0 μL，记录色谱图(图1)，由图1可见，空白溶剂在各待测物的出峰处没有干扰;取对照品溶液，按照1.4.2项中测定方法连续进样5次，记录色谱图(图2)。以各待测物与内标物的色谱峰计算，试验所用毛细管色谱柱理论塔板数大于5000;色谱图中，各待测物与相邻色谱峰分离度大于1.5;对照品溶液连续进样5次，所得各待测物与内标物峰面积之比的RSD值均小于5%，系统适用性试验结果见表1和表2。

图1 溶剂N，N-二甲基甲酰胺的色谱图

图2 甲醇、乙醇、甲苯和二氧六环(内标)的色谱图

表1 系统适用性结果

表2 进样重现性结果

1.5.2 精密度

1.5.2.1 重复性 取对照品溶液，按照 1.4.2 项中色谱条件连续进样6针，记录色谱图，以内标法计算各待测物的含量，计算RSD值，结果显示均小于2%(表3)。

表3 重复性测定结果

1.5.2.2 日间精密度 取对照品溶液，按照 1.4.2项中色谱条件，分别由不同的三人于第1、2、3天分别进样，记录色谱图，以内标法计算各待测物的RSD值，结果显示均小于5%(表4)。

表4 日间精密度试验结果

1.5.3 线性范围 精密取甲醇、乙醇和甲苯适量，置于10 mL容量瓶中加1 mL内标溶液，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，摇匀，分别配制成一系列不同质量浓度的甲醇、乙醇、甲苯和内标的混合溶液，按照1.4.2项中色谱条件进样，记录色谱图。以各待测物浓度(μg/mL)为横坐标，以各待测物与内标物的峰面积比为纵坐标，建立回归方程，甲醇、乙醇和甲苯的回归方程分别如表5所示。结果显示，各待测物R2＞0.99，线性关系良好。

表5 线性及范围结果

1.5.4 检测限及定量限 取各待测物线性最低浓度溶液，逐级稀释，按照1.4.2项中色谱方法进样。当信噪比为3时，将该待测物在沙咪珠利样品浓度记为检测限;同理，信噪比为10时，记为定量限。各待测物测定结果如表6所示。

表6 检测限与定量限结果

1.5.5 回收率 对沙咪珠利样品残留溶剂水平进行初步测定，测得乙醇浓度约为25 μg/kg。精密量取 31.68 mg甲醇、47.4 mg 乙醇、8.67 mg 甲苯，置于100 mL容量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，摇匀;精密量取该溶液 0.4、0.5、0.6 mL 各3份，分别置于9个10 mL容量瓶中，各加1 mL内标溶液;取9份沙咪珠利原料药(批号:20130308)0.1 g，精确称重，分别置于上述9个10 mL容量瓶，加N，N－二甲基甲酰胺定容至刻度，摇匀，即得。此时乙醇浓度分别为 18.96、23.7、28.44 μg/kg。选取乙醇浓度23.7 μg/kg作为回收率100%标准，按照1.4.2项中色谱方法进样。结果显示，各次测定回收率均为95% ～105%，且RSD＜5%。甲醇、乙醇、甲苯的回收率测定结果分别见表7、表8、表9。

表7 甲醇回收率测定结果

表8 乙醇回收率测定结果

表9 甲苯回收率测定结果

2 样品残留溶剂检测结果

取20130304、20130308、20130411 批次沙咪珠利原料药，按照1.3.3项中方法配制供试品溶液，按照1.4.2项中色谱条件进样，记录色谱图。经测定，各批次沙咪珠利样品中均未检出甲醇和甲苯，检出乙醇(图3)。沙咪珠利样品中乙醇测定结果如表10所示。

表10 乙醇残留溶剂检测结果

图3 沙咪珠利样品的色谱图

3 讨论

实验结果表明，沙咪珠利样品中未检出甲醇和甲苯，检出乙醇残留，其中每0.1 g沙咪珠利样品中含有乙醇浓度为 18.41 ～ 22.34 μg/mL，在样品中占百分比为0.184% ～0.223%，低于药典规定限度0.5%［5］。因此沙咪珠利原料药中的溶剂残留符合兽药典规定。

在选择色谱条件时，曾选用过弱极性的HP－5和DB－35ms毛细管柱。但由于甲醇和乙醇极性相近，二者在HP－5和DB－35ms色谱柱上无法实现基线分离，而使用极性较强的DB－WAX色谱柱后，可以满足色谱分离度要求。

由于研究中采用N，N－二甲基甲酰胺作为溶剂，其沸点较高，为152.8℃，因此进样口温度设定为180℃，目的在于使高沸点的N，N－二甲基甲酰胺溶剂能够在进样口瞬间全部蒸发;采用程序升温使得色谱柱在短时间内迅速升温至200℃，目的在于使N，N－二甲基甲酰胺的出峰时间提前，缩短分析时间。

本研究建立了测定沙咪珠利中甲醇、乙醇和甲苯溶剂残留的气相色谱方法。研究表明，本方法简单、精密度高、重现性好及检测限低。采用本方法能够很好的评价沙咪珠利合成工艺的残留溶剂水平。

［1］ 索 勋，李国清.鸡球虫病学［M］.北京:中国农业大学出版社，1998:166－167.

［2］ 韩春来，王丽明，郑明学，等.鸡球虫的耐药性研究进展［J］.畜禽业，2001，(4):32 －33.

［3］ 李佩国.河北省鸡柔嫩艾美耳球虫地方株的耐药性检测［D］.长春:吉林大学，2010.

［4］ 胡昌勤，刘 颖.药物残留溶剂的监控及其分析方法［J］.药学学报，2007，42(12):1237－1242.

［5］ 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版一部(附录81)［S］.