高效液相色谱法测定芩黄颗粒中甘草酸的含量

张 聪，赵秋君，张 阁

(1.国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳471003;2.洛阳惠中兽药有限公司，洛阳471013)

芩黄颗粒是在《伤寒论》“麻杏石甘汤”处方基础之上，经药味加减后研制开发的中药复方颗粒剂，已取得农业部三类新兽药注册证书。该制剂由黄芩、板蓝根、甘草、山豆根、麻黄、桔梗六味中药组成，具有清热解毒、止咳平喘的功效，临床用于鸡传染性支气管炎的预防及辅助治疗。为建立芩黄颗粒可控的质量标准，研究采用高效液相色谱法测定了芩黄颗粒中甘草酸的含量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Waters高效液相色谱系统(e2695型高效液相色谱仪;2489型紫外检测器;empower 2色谱软件);Agilent HC －C18柱，4.6 mm ×150 mm，5 μm(安捷伦公司，美国);AB265－S电子分析天平;HS3120型超声波清洗器。

1.2 试剂 甘草酸铵对照品，批号:121028－200507，中国药品生物制品检定所;芩黄颗粒由洛阳惠中兽药有限公司提供;甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取方法选择 精密称取样品2 g，置50 mL量瓶中，加流动相40 mL，超声提取60 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀;另精密称取样品2 g，置100 mL圆底烧瓶中，加流动相40 mL，90℃水浴回流提取60 min，放冷，转移至50 mL量瓶中，用流动相洗涤圆底烧瓶，洗液合并入提取液中，用流动相稀释至刻度，摇匀。取以上两种提取液，滤过，取续滤液测定，结果见表1。结果表明，两种提取方法甘草酸含量测定结果相差不大，考虑到超声提取操作简单，故选择超声提取的方法。

表1 不同提取方法对样品含量的影响 (n=3)

2.2 提取时间选择 精密称取样品2 g，置50 mL量瓶中，用流动相作溶剂，加入40 mL，分别超声提取10、20、30、40、60 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液测定，结果见表2。结果表明，随着提取时间的增加，提取液中甘草酸的含量逐渐增加，当提取时间超过30 min后，提取液中甘草酸的含量趋于稳定，说明超声30 min甘草酸提取已比较完全，故选择超声提取时间为30 min。

表2 不同提取时间对样品含量的影响 (n=3)

2.3 甘草酸的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Agilent HC－C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相为甲醇 －0.2 mol/L醋酸铵(65∶34，醋酸调节pH值至4.5);流速为1.0 mL/min;检测波长为 250 nm;进样量 10 μL。

2.3.2 甘草酸对照品溶液制备 精密称取甘草酸铵对照品10.72 mg，置50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。

2.3.3 供试品溶液制备 精密称取芩黄颗粒2 g，置50 mL量瓶中，加流动相适量，超声提取30 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，用滤膜滤过，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

2.3.4 专属性考察 按芩黄颗粒处方及工艺制备缺甘草的阴性对照样品，按上述2.3.3项方法制成阴性对照溶液。分别精密吸取甘草酸对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，阴性对照溶液在甘草酸对照品相应的保留时间处无干扰，见图1。

图1 专属性考察液相色谱图

2.3.5 线性关系考察 精密称取甘草酸铵对照品适量，加流动相溶解制成浓度为0.1994 mg/mL的甘草酸标准溶液，依次精密吸取标准溶液2.5、5、10、20、40 μL，注入高效液相色谱仪，以甘草酸峰面积(y)为纵坐标、进样量(x)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为 y=656.36x+5.8095(r=0.9999)。结果表明，甘草酸在 0.499 ～ 7.976 μg范围内，线性关系良好。

2.3.6 精密度试验 精密吸取甘草酸对照品溶液(0.1994 mg/mL)10 μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测得甘草酸峰面积RSD为1.1%，结果表明，本方法精密度良好。

2.3.7 重复性试验 精密称取同一批号的芩黄颗粒(批号:0501)2 g，按上述2.3.3项方法制备供试品溶液，平行制备6份，测得甘草酸的平均含量为4.9 mg/g，RSD为2.5%，表明本方法重复性良好。

2.3.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，测得甘草酸峰面积的RSD为1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的芩黄颗粒1 g，置50 mL量瓶中，精密加入甘草酸对照品储备液(0.8044 mg/mL)5 mL，平行操作6份，按2.3.3项方法制备加样回收供试品溶液，测定并计算加样回收率，测得平均回收率为99.3%，RSD为0.59%，表明方法准确度良好，结果见表3。

表3 回收率试验结果

2.3.10 样品测定 取3批芩黄颗粒，依法制备供试品溶液并测定，计算甘草酸的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

甘草具有补脾益气、清热解毒、止咳祛痰等功效，为本方之臣药，临床药理作用主要有镇咳祛痰、清热解毒、抗炎等，其主要有效成分为甘草酸和甘草次酸［1］，故本试验对甘草酸进行含量测定。

文献报道的甘草酸含量测定方法主要为高效液相色谱法［2－4］等，高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高等特点，因此本研究采用高效液相色谱法对甘草酸进行测定。已有较多学者研究报道高效液相色谱法测定甘草酸的含量，其流动相系统主要有:乙腈 －水 －磷酸系统［5］，乙腈 － 水 － 醋酸系统［2］，甲醇 － 水 － 醋酸铵－醋酸系统［4］，本研究过程中对乙腈－1%醋酸(33∶67)和甲醇 －0.2 mol/L醋酸铵 － 醋酸(65∶34∶1)2种流动相进行了比较，结果甲醇－0.2 mol/L醋酸铵－醋酸(65∶34∶1)系统中甘草酸分离度稍好，但分离度未达要求，用醋酸将pH调至4.5时，甘草酸的分离效果较好，分离度＞1.5，因此，将流动相调整为甲醇－0.2 mol/L醋酸铵(65∶34，醋酸调节 pH 值至4.5)。

本研究为建立了高效液相色谱法测定芩黄颗粒中甘草酸的含量，在该流动相条件下，甘草酸分离度良好，方法学考察表明该方法专属性、精密度、重复性良好，测定结果准确，可有效控制芩黄颗粒中甘草酸的含量，并为其质量标准的制定提供参考。

［1］ 梁 冰，杨爱馥，黄凤兰，等.甘草属(Glycyrrhiza)化学成分及药理作用研究进展［J］.东北农业大学学报，2006，37(1):115－119.

［2］ 杨先炯，王爱民，李勇军，等.高效液相色谱法测定珍珠滴丸中甘草酸含量［J］.中国药业，2008，17(3):12－13.

［3］ 王二兵，曲婷丽，赵正保.HPLC法测定参苓白术颗粒中甘草酸的含量［J］.山西医科大学学报，2008，39(1):38－40.

［4］ 王申东，胡 斯.HPLC测定苏菲止咳糖浆中甘草酸铵的含量［J］.中成药，2005，27(11):7－8.

［5］ 中国兽药典委员会.《中华人民共和国兽药典》二○一○年版二部［S］.