软皮汤对硬皮病小鼠模型皮肤组织中p-SMAD3、FLI1因子表达的影响

齐 庆，李永贤，陈英杰，李东海，朱 珂，查旭山

（1.广州中医药大学第一临床医学院、第一附属医院皮肤科，广东 广州510405；2.广州中医药大学第一临床医学院2009 级本科班，广东 广州510405）

软皮汤来源于邓铁涛教授治疗硬皮病的理论——硬皮病治疗时应以补肾益精为主，健脾养肺为辅。 软皮汤能减轻患者皮肤硬化症状，其具体机制仍不明确[1-2]。 前期研究提示，在体外其作用靶向于TGF-β 通路[3-4]，可能与活化因子SMAD3、抑制因子FLI1 之间的平衡变化有关[5]。 然而，机体复杂的微环境有别于体外细胞模型，诸多因素影响细胞因子作用；因此，有必要深入开展相关体内研究。 本研究将基于小鼠硬皮病模型，继续探讨软皮汤在体内对TGF-β 通路中SMAD3、FLI1 等因子“平衡”的影响，现将方法与结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性C57BL/6J 小鼠30 只，6～8 周龄， 体质量（20.0±1.4）g，购于中山大学实验动物中心，合格证NO.44008500000277。

1.2 主要试药与试剂

中药：补肾益精复方软皮汤处方来源于广州中医药大学第一附属医院皮肤科， 药物组成： 阿胶10 g，山茱萸10 g，熟地黄20 g，黄芪30 g，山药30 g，茯苓15 g，川红花5 g。 加蒸馏水1 200 mL，浸泡20 min 后， 沸煮45 min， 过滤收集药液。100 ℃水浴蒸发， 使药液浓缩至134 mL （生药量0.9 g/mL）。 博来霉素bleomycin（#9041-93-4）购于Aladin 公司。 Masson 染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所 （#D026）。 抗体：CollagenⅠ(#sc8788)、FLI1 (#sc356) 购 于Santa cruz 公 司；Fibronectin(#ab2413) 购 于Abcam 公 司；SAMD3 （#9532），p-SMAD3（#8828），β-Actin（#3700）购于Cell signaling technology 公司。 ECL 发光试剂盒购于广州永诺生物科技有限公司（#F0010）。

1.3 主要仪器

AB-160 型电子分析天平 （美国Denver 公司）；Power Tone XL 超薄切片机 （美国Boeckeler RMC 公司）；Olympus BXDX 光学显微镜 （日本Olympus 公司）；微型电泳电转移系统（美国Bio-Rad 公司）；BX 51 光学显微镜照相系统 （日本Olympus 公司）；CR 21G 高速冷冻离心机 （日本Hitachi 公司）。

1.4 造模与药物处理[6]

动物随机分成3 组，每组10 只，实验前在小鼠背部中央（1 cm×1 cm）剃去毛发。 正常对照组：以PBS 溶液100 μL 每日同一位点注射1 次， 生理盐水(0.2 mL/10 g)每日灌胃1 次。模型对照组：博来霉素PBS 溶液1 mg/mL 100 μL 每日同一位点注射1次，生理盐水(0.2 mL/10 g)每日灌胃1 次。软皮汤处理组：博来霉素PBS 溶液1 mg/mL 100 μL 每日同一位点注射1 次， 生药量0.9g/mL 软皮汤0.2 mL/10 g 灌胃，每日1 次。 连续处理4 周后，处死动物，收取注射区域皮肤。

1.5 Masson 染色

皮肤组织经多聚甲醛固定、 石蜡包埋后，5 μm连续切片。 染色前，石蜡切片经过脱蜡、水化处理。本实验按照Masson 染色试剂盒的方法开展：（1）细胞核染液染色2 min，倒掉细胞核染色液，冲水30 s；（2）胞浆染液染色40 s，倒掉胞浆染色液，冲水30 s；（3）分色液分色8 min；（4）蓝色复染液染色3 min， 倒掉复染液， 无水乙醇冲洗干净；（5）吹干后用无毒环保封固剂封片、镜检。

1.6 蛋白提取

称取约100 mg 的组织物， 记下质量， 加入700 μL 4 ℃预冷PBS，剪碎。 点动离心，重复3～4次， 倒去PBS。 加入RIPA 300 μL/100 mg 组织，vortex 震荡。匀浆机匀浆5～8 min。设置声仪：超声强度37%，0.8 s/次。超声12～15 次。16 000 g，4 ℃，离心30 min。 离心结束后取中间层液体-80 ℃冰箱保存备用。

1.7 检测方法

Western Blot 蛋白定量后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转膜。 5%脱脂牛奶封闭后，一抗4 ℃孵育过夜。 用TBST 洗膜2 次，每次7 min。 HRP 标记二抗室温下孵育1～2 h，用TBST 洗3 次，每次7 min。进行化学发光显影。 用Image J 分析目标条带的光密度值。 以β-Actin 为内参照， 比较CollagenⅠ、FLI1、Fibronectin、SAMD3 蛋白表达的差异。CollagenⅠ、FLI1、Fibronectin、SAMD3 的相对蛋白表达量=各个蛋白的光密度值/β-Actin 光密度值。p-SMAD3 相对表达量=各组样本p-SMAD3 光密度值/ SAMD3光密度值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Masson 三色染色观察硬皮病小鼠皮肤纤维化程度

经过Masson 三色染色病理切片，正常组纤维层染色最浅，软皮汤组稍高；模型组染色最深，显示其组织的纤维化明显。 由此可见，硬皮病小鼠经过软皮汤干预后，病变皮肤纤维化程度减轻，趋向正常水平。 如图1 所示（见封三彩图）。

2.2 各组小鼠皮肤组织CollagenⅠ和Fibronectin 蛋白表达水平的比较

小鼠皮肤CollagenⅠ和Fibronectin 的蛋白表达水平，在模型对照组均高于正常对照组和软皮汤组（P＜0.05）。 表明软皮汤可不同程度抑制模型小鼠皮肤中胶原相关因子CollagenⅠ、Fibronectin 的表达。见表1。

表1 各组小鼠皮肤组织CollagenⅠ和Fibronectin 表达（±s）

表1 各组小鼠皮肤组织CollagenⅠ和Fibronectin 表达（±s）

注：与正常对照组比较*P＜0.05；与模型对照组比较#P＜0.05。 下表同。

组 别正常对照组模型对照组软皮汤组n 10 10 10 Collagen Ⅰ1.00±0.05 3.52±0.16*1.22±0.05*#Fibronectin 1.00±0.04 2.58±0.14*1.31±0.07*#

2.3 各组小鼠皮肤组织中FLI1、SMAD3、p-SMAD3蛋白表达水平比较

SMAD3 在各组中的蛋白表达水平无明显差异；FLI1 的表达水平在模型对照组中均低于正常对照组和软皮汤组。p-SMAD3 在模型对照组中的表达水平均明显高于正常对照组和软皮汤组（P＜0.05）。 结果显示， 在硬皮病小鼠皮肤模型中，TGF-β 途径的p-SMAD3/FLI1 因子表达比值增大， 而经过软皮汤干预后，该比值有一定程度下降，虽与正常组仍有一定差距，但已趋向正常水平。 见表2。

表2 各组小鼠皮肤组织FLI1、p-SMAD3、SMAD3 的表达（±s）

表2 各组小鼠皮肤组织FLI1、p-SMAD3、SMAD3 的表达（±s）

组 别正常对照组模型对照组软皮汤组n 10 10 10 FLI1 1.00±0.04 0.33±0.02*0.92±0.05 p-SMAD3 1.00±0.03 4.62±0.23*1.53±0.08*#SMD3 1.00±0.03 0.98±0.05 1.02±0.05

3 讨论

硬皮病是复杂的自身免疫性疾病，临床辨病呈现病谱性变化，病谱一端为局限性硬皮病，另一端为弥漫型系统性硬皮病，两者之间包括CREST 综合征、Sine 硬皮病、嗜酸性筋膜炎等。 中医辨证分型主要分为肺脾亏虚型与脾肾亏损型。 虽存异质性变化，然其核心病理均不同程度在于：血管损伤、自身免疫、皮肤与内脏器官纤维化。 优良的动物模型是硬皮病研究的重要工具， 相对硬皮病细胞模型，硬皮病小鼠能更好地模拟疾病的体内复杂微环境以及核心病理变化。 本研究使用博莱霉素局部注射构建硬皮病小鼠模型[6]，可在机体内产生活性氧，诱导自身免疫反应，刺激成纤维细胞合成胶原。 在注射博莱霉素后， 小鼠逐渐出现局部皮肤萎缩变硬、毛发脱落、活动减少、食量下降、发育延缓、体质量减轻等表现。 由此可见，该疾病模型体现了硬皮病的主要症状，且一定程度地模拟了临床硬皮病患者的肺脾肾虚损之证。

针对硬皮病肺脾肾虚损，依“损者益之，虚者补之”补益原则，邓铁涛教授主张硬皮病治疗宜肺脾肾同治、补肾益精为法[1]。 据此，拟定治疗硬皮病的补肾益精法软皮汤：熟地黄补肾为君；黄芪、淮山药、阿胶补脾肺，养阴血，引药直达肌表之功为臣；山茱萸、茯苓加强补益脾肾之效为佐；红花为使，使诸药补而不滞；全方共奏健脾养肺、补肾益精之效。在临证中，软皮汤中药复方能不同程度改善患者纤维化症状[1-2]。 前期实验提示，软皮汤体外作用靶向于TGF-β 通路，与SMAD3、FLI1 平衡变化相关[5，7]。据此，本课题组提出SMAD3/FLI1“平衡”的概念。 研究显示，硬皮病小鼠SMAD3、FLI1 因子失衡，软皮汤中药复方可使硬皮病小鼠TGF-β 通路中活化因子SMAD3 与抑制因子FLI1 再平衡，皮肤纤维化程度减轻，Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白分泌减少。

SMAD3、FLI1 同属保守的转录因子网络，可相互结合成组织限制性异二聚体， 参与细胞增殖与组织特异性分化[8]。 在纤维化过程中， 二者均处于TGFβ 通路下游，效应部位位于细胞核内。 当TGF-β 通路静息时，FLI1 与胶原蛋白启动子结合， 抑制胶原蛋白转录；当TGF-β 通路活化时，SMAD3 竞争FLI1的启动子结合位点，促进胶原蛋白转录[9-10]。 本研究显示，软皮汤组、模型对照组与正常对照组活化因子SMAD3 表达量并无统计学差异， 而三组间主要差异在于磷酸化的SMAD3 因子（p-SMAD3）；软皮汤使硬皮病小鼠p-SMAD3 减少， 趋向正常对照组水平，而对SMAD3 量无明显影响；提示中药复方对活化因子SMAD3 的调节可能与磷酸化有关。与国外研究一致， 磷酸化的SMAD3 因子才是TGF-β 通路活化的标志；未磷酸化的SMAD3 位于胞浆内；仅当TGF-β 通路活化，SMAD3 被TGF-βⅠ型受体磷酸化，与协同性SMADs 形成复合物后进入核内，激活胶原相关基因转录[11]。 同时，软皮汤中药复方增加了硬皮病小鼠体内的抑制因子FLI1 表达，使其趋向正常水平， 可能增强了对胶原蛋白基因转录的抑制[9]。然而，中药复方通过何种途径影响了抑制因子FLI1的表达，其机制仍不明确，需要更进一步研究。

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图1 各组大鼠回盲部肠黏膜切片电镜观察图（HE，×400）