内皮型一氧化氮合酶基因多态性与高血压病发病相关性的研究

刘永生，韩洪波

（解放军第208医院1.心内科；2.内分泌科，吉林 长春130062）

原发性高血压（EH）是随着近年人口老龄化及人们生活水平提高而发病率大为提高的疾病之一。其引发的残疾和病死都是较大的问题，且其病因不详，因而没有确且的对因治疗措施，患者中绝大部分需要终生服药治疗，是一种难治的慢性疾病。当今世界范围内已公认其为“无声健康杀手”。众所周知长期高血压的患者易患多种心脑血管疾病，严重影响心、脑、肾等人体重要脏器结构与功能，如果高血压病患者的血压控制未能达到正常血压指标，最终可导致这些脏器的功能衰竭[1]。基于如上情况，在基因水平探讨高血压病的发病相关因素已成为必然。已有诸多研究证实血NO水平与高血压患者的血压水平等因素存在某种相关关系，因而NO的代谢在高血压病的病因研究中是值得加以深入研究的。而NO合成的限速酶基因也就自然被列入高血压病的病因相关候选基因。本实验就是着重研究内皮型NO合成酶（eNOS）基因多态性与高血压发病相关性的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

高血压病组：2009年10月至2011年10月就诊于解放军208医院心内科门诊的初诊高血压病患者，做各项相关辅助检查排除继发性高血压、糖尿病、重度贫血、甲状腺功能亢进、泌尿系感染、肾炎、高血钾、严重心肾功能不全，经评估很高危高血压病患者不纳入实验，儿童、妊娠妇女以及近期有脑出血、脑梗塞患者也为本实验的排除对象。如上实验对象共计215例，均自愿加入本实验研究。其中男114例，女101例。年龄54.37±13.15岁。

对照组：同期就诊于我院体检中心参加体检的中老年人，经各项检查排除高血压病及糖尿病，自愿参与本实验，共计108例，男55例，女53例。年龄55.13±12.98岁。此组与实验组间男女比例及年龄均经统计学检验示两组间无明显差异。全部实验对象均为汉族，且相互间无血缘关系。

1.2 模板DNA的制备 所有实验对象均采集空腹肘静脉血4ml，用EDTA－K2抗凝，采用已建立的碘化钠裂解、氯仿及戊醇提取法[2]提取白细胞基因组DNA，－30℃保存备用。

1.3 引物合成 所有引物均由上海生物工程有限公司合成 ① 应用Printer引物设计软件设计一对引物，用于扩增eNOS启动子区的一段DNA序列。上游引物：5′－ATGCTCCCACCAGGGCATCA－3′，下游引物：5′－GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG－3′。②同样应用Printer引物设计软件设计一对引物，用于扩增eNOS第七外显子区的一段DNA序列。 上游引物：5′－AAGGCAGGAGACAGTGGATG－3′，下游引物：5′－CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCT－3′。

1.4 扩增条件 ①eNOS基因启动子－786区：扩增条件PCR反应体系为30μl，其中含有已提取模板DNA100ng，10×PCR缓冲液3.0μl，Taq酶（上海生工生物工程有限公司产品）2.0U，15mmol／L三磷酸脱氧核糖核苷 （dNTPs）0.5μl，上、下游引物各1μl。PCR反应条件为：97℃预变性5min，然后94℃45s，55℃50s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10min。4℃保存。以上所用主要仪器为Primus25型PCR仪。②eNOS基因第七外显子第894位点上下游区：扩增条件PCR反应体系为50μl，其中含有已提取模板DNA100ng，10×PCR缓冲液4 μl，Taq酶 （上海生工生物工程有限公司产品）2.0U，15mmol／L三磷酸脱氧核糖核苷 （dNTPs）0.5μl，上、下游引物各1μl。PCR反应条件为：97℃预变性5min，然后94℃30s，65℃50s，72℃60 s，30个循环后，72℃延伸10min。4℃保存。以上所用主要仪器为Primus25型PCR仪。

1.5 扩增产物的限制性酶切及电泳 ①eNOS基因启动子－786区：取 PCR扩增产物10μl，用10UNgOAIV酶（Prpmega Corporation公司）于37℃酶切16h。反应终止后，产物经3%琼脂糖凝胶100V 电泳1.0h，银盐染色，染色后以DL100DNA片段长度标准物为参照物，在紫外灯下判断结果，并拍照。②eNOS基因第七外显子第894位点上下游区：取PCR扩增产物10μl，用BanⅡ8U（Prpmega Corporation公司）于37℃酶切10h。反应终止后，产物经3%琼脂糖凝胶100V电泳1.0 h，EB染色，染色后以DL200DNA片段长度标准物为参照物，在紫外灯下判断结果，并拍照。

1.6 统计学处理 用基因直接计数法计算两组人群的基因型及等位基因频率，不同人群间基因型及等位基因频率用χ2检验，以P＜0.05为具有显著性差异。其他诸如OR及95%CI均在SPSS13.0软件包上完成。

2 结果

2.1 eNOS基因启动子－786区基因型分析 PCR扩增产物大小为236bp，此研究位点的T／C突变可导致限制性内切酶NgOAIV的酶切位点产生，根据酶切状况分析基因型有3种，TT型为正常纯合子（236bp，1条带），TC型为突变杂合子（236，203，33 bp，共3条带），CC为突变纯合子 （203，33bp，共2条带），据条带数目可以判断基因型。

2.2 eNOS基因第七外显子第894位点上下游区基因型分析 PCR扩增产物大小为248bp，此研究位点的G／T突变可导致限制性内切酶BanⅡ的酶切位点消失，根据酶切状况分析基因型有3种，GG型为正常纯合子 （163，85bp，共2条带），GT型为突变杂合子（248，163，85bp，共3条带），TT为突变纯合子 （248bp，1条带），据条带数目可以判断基因型。

2.3 两组人群eNOS基因启动子－786位点T／C多态性比较 如上多态性分布在高血压病组与正常健康中老年人组的分布频率有显著差异性 （P＜0.05），见表1。

表1 两组人群eNOS基因启动子－786位点T／C携带频率分布〔n（%）〕

2.4 两组人群eNOS基因第七外显子894位点G／T多态性比较 如上多态性分布在高血压病组与正常健康中老年人组的分布频率差异有显著性 （P＜0.05），见表2。

表2 两组人群eNOS基因第七外显子894位点G／T携带频率分布〔n（%）〕

2.5 两组人群间eNOS基因启动子－786位点T／C及第七外显子894位点G／T的基因型频率分布及风险系数 当eNOS基因启动子－786位点及第七外显子894位点的基因型为TT＋GG时，患病的相对风险度OR值为0.799，可见患病的风险度明显减低。而如上两基因位点的基因型为TC＋TT或CC＋TT时，患病的相对风险度OR值分别为1.511及1.676，可见患病的风险度明显增高。可见TT＋GG可能是高血压病的保护性基因，而可以看出CC＋TT除与高血压的发病有一定程度相关性外，二者在高血压的发病中可能具有一定程度的协同作用，见表3。

表3 两组人群间eNOS基因启动子及第七外显子基因型和频率分布及风险系数

3 讨论

对于许多原因未明的疾病人们一直渴望在基因水平发现其发病的某些相关因素，一旦某一疾病的病因在基因水平得以阐明，那么发现这种疾病的最为行之有效的治疗方式也将随之成为可能。

有统计数字表明，随着近年人们生活水平的日益提高，高血压病的发病率呈现上升趋势。与此同时心血管病的组成也有了改变，目前产前筛查方式的完善和抗生素的应用已使心血管病中的先天性心脏病和风湿性心脏病的比率大大减低，而人口的老龄化却使高血压性心脏病患者在心血管病中的比率大为增加。作为一种中老年人群中的常见病，高血压病后果较为严重，其病因一直是研究热点问题之一。

血管内皮不仅是血流与组织间液屏障的重要组成部分，也是血管功能的重要调节因子产地之一，血管内皮具有强大的旁分泌功能，其分泌多种血管活性物质用以调节血管的舒缩。一氧化氮（nitric ox－ide，NO）就是其中较重要的一种，NO又名内皮源性舒张因子，是一种作用极强的舒张血管物质，在调节血压和维持血压稳定中起重要作用。NO可调节血管的基础张力和维持基础血压的稳定性。除此之外NO还具有较为强大的抗血栓作用，它可以抑制血管内皮损伤而引发的血小板聚集及粘附，可以拮抗血栓形成过程[3]。血NO水平下降是高血压患者的危险信号之一[4]。已有研究表明，高血压病的发生与进展与血管内皮损害、血小板激活并聚集及各种血管炎性因子异常表达有一定相关性[5]，也就是说与NO水平的异常密切相关[6]，不仅如此，NO水平的紊乱程度还与血压自身节律性的破坏和靶器官损害有必然的相关性，因此，对于NO生成的限速酶基因的研究成为了近年高血压病相关基因的研究热点。

正常情况下人体内即有一定浓度的NO存在，NO是由L－精氨酸在NO合成酶（NOS）的作用下生成的，是一种生物效价很高的具有广泛生物活性的信使分子。在哺乳动物中NOS主要有三种类型，分别为神经型、诱导型和内皮型，eNOS主要存在于血管内皮细胞，因而被称为内皮型NOS，是在高血压病的发生发展中最有可能起作用的NO合成限速酶[7]。

eNOS由1025个氨基酸残基组成，相对分子量为13.3kDa。人eNOS基因定位于染色体7q35－q36，全长21－22kb，包括25个内含子和26个外显子。eNOS基因存在多种多态性变异，但目前研究较多的是基因启动子－786位点T／C及第七外显子894位点 G／T多态性[8]。

启动子是位于编码基因上游的特异DNA序列，对于基因表达的转录水平起重要调节作用，是RNA聚合酶的结合部位，操纵着基因由DNA－RNA－蛋白质一级结构的启始，而这一基因区的变异将会对RNA转录有一定程度的影响，也自然会对eNOS表达产生阻碍作用。而eNOS基因第七外显子894位点所编码的是eNOS蛋白一级结构中的第298位氨基酸，如果此位点发生G／T突变，则原来的谷氨酸（Glu）会被天门冬氨酸（Asp）所取代，而这一位点的谷氨酸正位于此蛋白质二级结构α螺旋的中心部位，Glu－Asp的错义突变会导致eNOS二级结构构象发生变化，会由α螺旋转变为β折叠，进而影响蛋白质三级结构的形成，也就自然会影响到eNOS的活性[9]。

当eNOS基因启动子－786位点及第七外显子894位点的基因型为TT＋GG时，患病的相对风险度低。而如上两基因位点的基因型为TC＋TT或CC＋TT时，患病的相对风险度明显增高。可见TT＋GG可能是高血压病的保护性基因。而CC＋TT是如上两基因位点同时突变的基因型，且两基因位点虽未在eNOS表达同一水平起作用，但因最终均会影响到eNOS的效价，两者在高血压的发病中表现出的协同作用是发病中可能具有一定程度的协同作用是有科学依据的。事实上高血压病的发病除与一定的遗传因素相关外，还与许多环境因素及其他诸多外因有关[10]，虽如上两基因位点同时突变对高血压的发病有协同作用，但这并不表明具有如上基因型的人群就100%会患高血压病。另外，在两基因位点的协同作用研究上，因基因型分组较多，使得各组样本量较小，要得到肯定性结论仍需加大样本量进一步研究。

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