超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中7种药物残留

张崇威，班付国，宋志超，陈 蔷，吴宁鹏

（河南省兽药监察所，郑州450008）

随着畜牧业发展，用于预防和治疗禽畜疾病的兽药品种也不断增加，人药兽用以及兽用药物残留超标的现象也越来越多［1］。阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素、头孢匹林、头孢拉定属于人用药物，尚未批准在兽医临床上使用，但在实际的畜产品药物残留检验中却时有发现。头孢氨苄、头孢噻肟作为常用兽药在养殖环节中被滥用导致残留量超标现象严重。造成这种现象的原因，主要是由于一些不法养殖者在养殖过程中违规使用，从而造成在禽畜产品中的残留超标。为打击和防范违法使用和滥用这些药物，有必要建立这7种药物残留的同步检测技术。目前，对于此7种药物的单个或多个检测方法也分别有报道，已报道的有13种林可胺类及大环内酯类药物的检测［2］，以及13种β-内酰胺类药物残留检测［3］，但是同时测定该7种药物残留的检测方法尚未见报道。本研究建立了7种药物残留的快速、准确、同步检测的液相色谱-串联质谱方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 Acquit UPLC-Xevo TQ-S质谱联用仪（Waters公司）；3K-30台式高速冷冻离心机（Sigma公司）；R215 Professional旋转蒸发仪（瑞士 Buchi公司）；IKAMS3.Basic圆周振荡器（广州仪科实验室技术有限公司）；ALC-2100.2电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；VX-Ⅲ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）。

1.2 试剂 甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，实验用水为一级水；阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素、头孢氨苄标准品来源于中国兽医药品监察所，头孢匹林、头孢噻肟、头孢拉定标准品来源于中国药品生物制品检定所。

1.3 标准贮备液的配制 分别精密称取7种标准品各约10 mg，置于10 mL量瓶中，阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素标准品用乙腈溶解并稀释成约1 mg／mL的标准贮备液；头孢氨苄、头孢匹林、头孢噻肟、头孢拉定用50%乙腈溶液溶解，并稀释成浓度约1 mg／mL的标准贮备液。然后用50%乙腈溶液逐步稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温 30 ℃；流动相 A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液；进样量 5 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 色谱梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测 MRM；离子源温度150℃；雾化温度500 ℃；雾化器流速1000 L／h；锥孔气流速150 L／h；毛细管电压2.9 kV；定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 7种药物定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞能量

1.4.3 样品前处理 称取2±0.02 g匀质样品，置于50 mL 离心管内，加乙腈溶液（15+2，V／V）10 mL，涡旋混匀，中速振荡10 min，8000 r／min 离心5 min，转移上清液于另一50 mL离心管内。重复提取一次，合并提取液。向提取液中加正己烷8 mL，涡旋混合 5 min，5000 r／min 离心 5 min，吸取下层溶液10 mL于鸡心瓶中，50℃下旋转蒸发至干，加入2.00 mL 20%乙腈溶液溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱检测。

2 结果

2.1 线性关系 精密吸取200 μg／L的标准混合中间液 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL，分别加入鸡心瓶中，并向其中加入 10 mL空白基质，从“50℃下快速旋转蒸发至干”开始，按照样品同步处理。 从而配制成 2、5、10、20、50、100 μg／L 的系列标准溶液，并依次上机，以各药物的质量浓度为横坐标，定量离子的质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（表 3），可以看出 7种药物在 2～100 μg／L范围内呈现出良好的线性关系，相关系数均在0.998以上。

表3 7种药物的标准曲线及相关系数

2.2 检测限和定量限 向空白猪肉、鸡肉、鸡蛋试样中添加适量的混合标准溶液，经处理上机。根据特征质量色谱峰的信噪比S／N＞3为检测限，S／N＞10为定量限，检测到阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素的检测限为 0.5 μg／kg，定量限为 1 μg／kg，头孢氨苄、头孢匹林、头孢噻肟、头孢拉定的检测限为2 μg／kg，定量限为 4 μg／kg。

2.3 方法的灵敏度和准确度 分别在猪肉、鸡肉、鸡蛋组织中添加 4、8、20 μg／kg的 7 种药物进行回收率试验，每个浓度做5个平行，连续测定3批，其平均回收率、变异系数如表4。阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素的回收率在80%～100%之间，头孢氨苄、头孢匹林、头孢噻肟、头孢拉定的回收率在70%～90%之间，批内批间的变异系数均小于20%。图1为空白鸡肉中添加8 μg／kg的各药物特征离子质量色谱图。

表4 7种药物的标准曲线及相关系数

图1 空白鸡肉中添加8 μg／kg的7种药物特征离子质量色谱图

3 讨论与小结

3.1 色谱条件的优化 由于头孢类药物结构中含有较强酸性的羧基，在以硅胶为固定相中易出现拖尾和峰形异常的现象，因此选用高纯硅胶为基体并经端基封闭的反相色谱柱作为色谱分析柱［2］。已报道的流动相有甲酸铵水溶液和乙腈［4］，考虑到流动相中有机溶剂含量、离子强度以及pH值大小，都会对阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素的离子化强度、溶解性以及在色谱柱上的分离产生影响［5］。所以，实验选用乙腈和0.1%甲酸溶液为流动相，并进行梯度洗脱，得到了分离度以及对称因子均较好的峰形。

3.2 质谱条件的优化 首先采用以100 ng／mL的各种药物的标准溶液在ESI+的模式下进行母离子扫描，确定准确的准分子离子，然后测出相应2个子离子，并优化锥孔电压和碰撞能量等质谱参数，使其相应的响应值达到最大。

3.3 提取液的优化 阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素属弱碱性药物，易溶于酸性水溶液和极性较大的有机溶剂，这类药物的提取和净化主要依据其弱碱性、脂溶性和酸不稳定性进行优化［5］，已报道提取溶剂有 Tris 缓冲液［6］、偏磷酸-甲醇溶液［7］、甲醇和乙腈等，而头孢类药物由于本身结构带有羧基基团，所以在碱性环境中水溶性较好，已报道的提取液有磷酸盐缓冲盐（pH 8.5）［8］、0.5%的冰醋酸水溶液［4，9］，乙腈等，本实验综合考虑了阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素以及头孢类药物的溶解性之间的差异和相近之处，并考察乙腈 ∶水＝95∶5（V／V）、乙腈 ∶水＝90 ∶10（V／V）、乙腈 ∶水＝80 ∶20（V／V）、乙腈 ∶水＝15∶2（V／V）作为提取液，发现提取液为乙腈 ∶水＝90∶10（V／V）或者乙腈比例增加时，头孢类的提取效率非常低，而当提取液为乙腈∶水＝80∶20（V／V）或者水比例再提高时，阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素的提取率就比较低，最终确定乙腈 ∶水＝15∶2（V／V）溶液作为提取液。

3.4 净化条件的优化 阿奇霉素、克林霉素、罗红霉素的净化方法常用液液萃取、固相萃取等方法，已报道的固相萃取柱有 C18、HLB、SCX 柱等［2］。头孢类药物的净化方法有固相萃取，已报道的固相萃取柱有 Oasis HLB［8］、XAD-2 固相萃取等［9］。 可见，7种药物提取液的净化柱可以采用HLB柱，但经HLB柱净化后头孢类药物的回收率较低，且过柱时容易堵塞，本实验考虑到样品基质特性，采用液液萃取的方法用正己烷除去脂肪等极性较小的杂质，省去固相萃取的步骤，使得前处理简洁经济，同时也得到了满意的实验结果。

本研究通过摸索，得出乙腈与水适宜比例的溶液用于同时提取7种药物，同时优化液相色谱条件和质谱条件，从而建立了猪肉、鸡肉、鸡蛋中7种药物同时检测的UPLC-MS／MS方法，并且其灵敏度和准确度满足药物残留的分析。

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