高效液相色谱法同时测定复合维生素B注射液中4种维生素的含量

陆春波，穆 琳，蔡文金

（浙江省兽药饲料监察所，杭州310020）

复合维生素B注射液为复方制剂，主要用于防治维生素缺乏所致的多发性神经炎，消化障碍，癞皮病，口腔炎等。复合维生素B注射液收载于农业部1960号公告［1］，该标准只对维生素 B1、核黄素磷酸钠的含量进行了测定，其中维生素B1测定方法为重量法，核黄素磷酸钠测定方法为紫外-可见分光光度法。本研究在参考文献［2-4］的基础上，建立了高效液相色谱法同时测定本品中维生素B1、核黄素磷酸钠、维生素B6、烟酰胺含量的方法，结果较为满意。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱，配Waters 2487紫外检测器（美国Waters公司）；XS-205电子天平（Mettler公司）。

1.2 试剂 甲醇、冰醋酸、庚烷磺酸钠为色谱纯；三乙胺为分析纯；水为超纯水。

1.3 对照品 维生素B1对照品，批号为00311，含量为95.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；核黄素磷酸钠对照品，批号为SLBD2777V，含量（以维生素B2计）为70.0%，SIGMA-ALDRICH公司；维生素B2对照品，批号为 11021，含量为 99.2%，德国 Dr.Ehrenstorfer公司；维生素B6盐酸盐对照品，批号为11020，含量为100.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；烟酰胺对照品，批号为 100115-200703，含量为99.9%，中国食品药品检定研究院。泛酸钙对照品，批号为100370-200301，供含量测定用，中国食品药品检定研究院。

1.4 供试品 复合维生素B注射液，规格为10 mL，含维生素B1100 mg、核黄素磷酸钠13.7 mg（以维生素B2计10 mg）、维生素 B610 mg和烟酰胺150 mg， 批号分别为20140301、20140302、20140303，均由浙江金力制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品储备液的制备 取维生素B1对照品约100 mg，核黄素磷酸钠对照品约10 mg，维生素B6盐酸盐对照品约10 mg和烟酰胺约150 mg，精密称定，置同一25 mL棕色量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，作为混合对照品储备液。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密量取混合对照品储备液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取供试品1 mL，置25 mL棕色量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.1.4 空白溶液的制备 取泛酸钙对照品50 mg，加水至100 mL，作为空白供试品；精密量取1 mL，置25 mL棕色量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为空白溶液。

2.2 高效液相色谱条件 采用Agilent Eclipse XDB C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相 A：三乙胺-冰醋酸-甲醇-0.015 mol／L庚烷磺酸钠（0.2 ∶7.5 ∶75∶820），流动相 B：甲醇，梯度洗脱（表1）；检测波长 280 nm；流速 1.0 mL／min；柱温30 ℃；进样量 20 μL。

表1 流动相梯度参数

2.3 线性考察 精密量取 1、2、3、5、10 mL 对照品储备液，分别置50 mL棕色量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件分析，以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，所得线性方程和相关系数结果见表2。

图1 核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素B6、维生素B1混合对照品溶液HPLC色谱图

图2 供试品溶液HPLC色谱图

表2 维生素B1、核黄素磷酸钠、维生素B6、烟酰胺线性结果

2.4 专属性考察 按2.2项色谱条件，分别对混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶液进行分析（结果见图1、图2、图3）。结果表明：空白溶液在核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素B6、维生素B1峰处无吸收峰，核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素B6、维生素B1的理论板数均大于3000，核黄素磷酸钠与烟酰胺分离度为6.6；烟酰胺与维生素B6分离度为15.7；维生素B6与维生素B1分离度为16.5。

用维生素B2对照品代替核黄素磷酸钠对照品，配制方法同2.1.1项和2.1.2项，液相色谱图如图4所示。

图3 空白溶液HPLC色谱图

图4 烟酰胺、维生素B2、维生素B6、维生素B1混和对照品溶液HPLC色谱图

2.5 回收率试验 取维生素B1、核黄素磷酸钠、维生素B6、烟酰胺对照品适量，用空白供试品溶解并稀释至刻度，摇匀，作为添加样品，进行加样回收率试验，以考察方法的准确度。每个浓度各制备3份平行样，结果见表3。

表3 回收率试验结果

2.6 重复性试验 取同一份供试品溶液，连续重复进样6次，记录峰面积，计算RSD，核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素 B6、维生素 B1的 RSD分别为0.3%，0.3%，0.2%，0.2%。

2.7 溶液稳定性试验 取混合对照品溶液，分别于 0、2、4、6、8、12 h 进样，核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素 B6、维生素 B1的 RSD分别为 0.5%，0.3%，0.2%，0.2%。结果表明，供试品溶液在 12 h内稳定。

2.8 样品测定 取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素B6、维生素B1含量，结果见表4。

表4 样品中核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素B6、维生素B1含量测定结果（n＝3）

3 讨论与小结

3.1 检测波长的确定 取核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素B6、维生素B1对照品适量，用流动相A溶解后，在400～200 nm的波长范围内扫描，核黄素磷酸钠、烟酰胺、维生素 B6、维生素 B1分别在 267、261、291、246 nm波长处有最大吸收，综合考虑，选择280 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择 流动相中加入三乙胺，可以消除碱性物质的拖尾现象，特别对于含有叔胺结构的维生素B1更有明显的作用。曾用流动相A作等度洗脱，维生素B1的出峰时间过长，为了缩短分析时间，选择了梯度洗脱。

3.3 农业部1960号公告方法的不足之处 农业部1960号公告关于复合维生素B注射液中的维生素B1、核黄素磷酸钠的含量测定方法采用的是重量法和紫外-可见分光光度法。重量法测定维生素B1的操作较为复杂；采用的垂熔玻璃坩埚的号数对结果影响较大；且洗涤溶剂丙酮对人体有危害。紫外-可见分光光度法测定核黄素磷酸钠，如果有维生素B2的干扰，核黄素磷酸钠和维生素B2均有吸收，用该方法测定的应为两者之和。

本文对色谱条件、方法线性、专属性、回收率和重复性等方面进行考察后，建立了高效液相色谱法。实验结果表明，该方法操作简便、结果准确，能有效检测复合维生素B注射液中4种维生素的含量。

［1］中国兽药典委员会.农业部1960号公告.兽用国家标准（化学药品、中药卷）第一册［S］.

［2］李祥胜，阚家义.复合维生素B注射液中4种维生素的含量测定［J］.安徽医药，2009， 13（7）： 755-756.

［3］周 杰，梁建军，王晨光.复合维生素B注射液的含量测定［J］.河北化工， 2007，30（4）： 46-47.

［4］陈光龙，李玉兰，刘 敏，等.高效液相色谱法同时测定复合维生素B片中4种组分的含量［J］.中国医院药学杂志，2006， 26（10）： 1256-1258.