大鼠功能性便秘模型建立方法的研究＊

谢 培 周永学▲ 陕西中医学院（咸阳712046）

△陕西省胃肠病证方药重点研究室（咸阳712046）

功能性便秘是常见的胃肠疾病，发病率高，危害面广，但迄今为止，现代医学对FC的病因和发病机制仍然不十分清楚［1］，研究其发病机制及诊治方法对指导临床用药具有重要意义，而功能性便秘动物模型的建立是实验研究的基础，因此探讨功能性便秘模型的建立更具有研究意义。目前功能性便秘模型的建立多以小鼠为目标动物［2－4］，但因小鼠耐受力较弱，不适宜长期造模给药，且主要用于观察排便实验，制约了有关机制探讨的研究。因此本实验以大鼠为研究对象，选取国内外报道中最具优势的复方地芬诺酯造模，探讨如何建立持续而稳定的功能性便秘大鼠动物模型。

1 材 料1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠，90只，体重200－250g，购于西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号：SCXK（陕）2012－003，经检验合格及适应性饲养1周后备用。

1.2 药品及试剂 复方地芬诺酯片，江苏常州康普药业有限公司，批号：1304042；大鼠胃动素Elisa检测试剂盒，批号：23007331；大鼠胃泌素Elisa检测试剂盒，批号：23007914上海西唐生物技术有限公司；水合氯醛：上海山浦化工有限公司，生产日期：2012年11月10日。

1.3 仪器与设备 酶标仪：ELX808，美国Bio－Tek公司；离心机：KDC－40低速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司。

2 方 法2.1 分组 取SD大鼠90只，体重220－250g，随机分为6组，每组15只，设空白组、复方地芬诺酯8mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg剂量组。

2.2 复方地芬诺酯混悬液的制备 将复方地芬诺酯片（每片含盐酸地芬诺酯2.5mg，硫酸阿托品0.025mg）以研钵研磨至极细粉末，用蒸馏水按各剂量组所需浓度配置成复方地芬诺酯混悬液备用。

2.3 建立模型 造模方法根据文献报道［5］进行改进：动物禁食不禁水12小时后，分别以10mL/kg体积（8mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL浓度）按组别灌胃复方地芬诺酯混悬液，每天一次，给药6周。

2.4 指标的检测 2.4.1 一般行为学观察：每两周大鼠称重一次；每日观察动物临床表现及排便情况，详细记录，统计各组大鼠的死亡数，分析死亡原因。

2.4.2 血清生化指标的检测：末次给药后2h，腹腔注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉，下腔静脉采血，室温放置30min后，将KDC－40低速离心机调至3000转/分，10min后分离待测血清，根据大鼠胃动素、大鼠胃泌素Elisa试剂盒说明书检测血清胃动素、胃泌素含量。

2.5 统计学采用 SPSS17.0处理数据，计量资料采用（±s）表示，计量资料比较采用单因素方差分析；计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果3.1 一般行为表现 造模后各组大鼠相继出现精神状态差，喜扎堆，活动减少，进食减少，大便粒型小、干硬，尤以30mg组出现最早，症状最为明显；给药第6天，20mg和30mg组个别动物出现尿道口白色米粒样分泌物，小便点滴而出，尿道外口周围皮毛濡湿，初步推断为尿道不畅，30mg组个别动物甚至出现血尿；第9天，15mg组个别大鼠出现尿道口白色米粒样分泌物；第11天20mg组大鼠逐渐出现血尿，进食少，精神状态差；第13天，30mg组有大鼠死亡，解剖见，其胃及肠道内无实质性内容物仅有少量水液，肠壁薄而透明，左肾萎缩，肾实质及髓质部分已代偿性坏死，右肾色泽暗黑。第15天，30mg组4只大鼠出现小便呈米泔水样，且淋漓而下；随着造模的继续，20mg和30mg组大鼠死亡逐渐增多，解剖可见其膀胱极度胀大，内有大量储留小便其胃内仅有少量水液，肠道呈结节状，内有大量颗粒状粪便，肠壁薄而透明，其双肾色泽暗红而稍有肿大。至造模结束，除8mg/kg剂量组外，其余各组与空白组对比均有精神状态差，活动减少，扎堆，体重减轻，进食减少，被毛脱落，大便干硬，粒型小，符合便秘表现［6］。

3.2 不同剂量复方地芬诺酯对大鼠体重和死亡率的影响与空白组比较，两周后各造模组大鼠体重均有差异；造模四周后和六周后，8mg/kg剂量组未见明显差异（P＞0.05），与其余各组对比均有显著性差异（P＜0.01），随着造模时间的延长，除8mg和15mg组外，其余各造模组均有大鼠死亡，且与剂量的大小成正比关系，其死亡率经卡方检验显示，有显著差异。结果见表1。

表1 不同剂量复方地芬诺酯对大鼠体重及死亡率的影响（g，±s，n＝15）

表1 不同剂量复方地芬诺酯对大鼠体重及死亡率的影响（g，±s，n＝15）

注：各给药组与空白组比较 △P＜0.05 ▲P＜0.01。

组造模前 造模后二周 造模后四周 造模后六周 死亡率空白组 221.23±6.08 265.66±9.67 389.16±14.54 419.57±24.66 0/别15 15 8mg组 222.29±5.63 251.28±14.60△ 386.14±11.30 415.07±20.85 0/15 15mg组 222.80±7.47 246.37±5.87▲ 334.96±26.01▲ 324.57±52.51▲ 0/15 20mg组 222.61±5.54 227.10±4.87▲ 345.68±31.82▲△ 343.89±51.31▲ 2/15 25mg组 222.32±5.68 221.53±7.70▲ 302.66±16.81▲ 302.09±44.35▲ 4/15 30mg组 221.73±6.85 203.49±5.83▲△ 283.73±18.48▲△ 301.53±16.60▲ 7/

表2 不同剂量复方地芬诺酯对大鼠血清中胃动素和胃泌素含量的影响（g，±s，n＝15）

表2 不同剂量复方地芬诺酯对大鼠血清中胃动素和胃泌素含量的影响（g，±s，n＝15）

注：各给药组与对照组比较 △P＜0.05 ▲P＜0.01。

组109.09±5.83 13.83±1.16 8mg组 109.85±2.19 13.69±0.95 15mg组 98.16±5.20▲ 10.96±0.33▲20mg组 89.84±4.77▲ 11.80±1.06▲25mg组 77.76±3.13▲ 9.27±1.05▲30mg组 74.07±3.48▲ 9.48±1.44胃动素 胃泌素空白组别▲

3.3 不同剂量复方地芬诺酯对大鼠血清胃动素和胃泌素含量的影响 与空白组比较，8mg组大鼠血清胃动素和胃泌素含量未见明显差异（P＞0.05），其余各造模组大鼠血清中胃动素、胃泌素含量均显著减少（P＜0.01），且与剂量大小成一定相关性。

4 讨 论复方地芬诺酯［7］由盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品组成。盐酸地芬诺酯为人工合成的具有止泻作用的阿片生物碱，现已代替阿片制剂成为广泛而有效的非特异性止泻药，它直接作用肠平滑肌，能提高肠张力、抑制肠蠕动，使肠内水分吸收增加，致使排便减少或排便困难，从而引起便秘。利用地芬诺酯灌胃是目前应用最为广泛的的动物便秘模型复制方法，但多用于复制小鼠便秘模型［8－14］，尚无应用地芬诺酯灌胃复制大鼠便秘模型的报道。在便秘的实验研究中，小鼠多用来进行肠道的蠕动实验，但小鼠体积小，标本量小，从而限制了胃肠道神经递质、胃肠道激素以及肠道电生理指标的观察。大鼠易饲养，成本可控，体型大小合适，给药容易，采样量合适方便，几乎已被用于各种药物的筛选及药效评价，尤其在某些药物的筛选中大鼠还具有独特优势，所以本实验以大鼠为研究对象，采用不同剂量的地芬诺酯灌胃，对便秘模型进行探索研究。

研究发现，15mg以上各组大鼠造模后相继出现大便粒型小、便质干硬，便量少的显著便秘的表现，同时伴有精神状态差，喜扎堆，活动减少，进食减少等表现；通过对体重以及死亡率的分析，15mg组大鼠不但有大鼠便秘的临床表现，而且体重出现明显减轻且动物无死亡；胃肠道激素检测结果也进一步证实，15mg组大鼠胃肠道激素含量明显降低。因此可知，复方地芬诺酯15mg/kg/天灌胃，约2周后即可成功复制大鼠功能性便秘模型。

本次造模发现15mg组灌胃两周便可出现明显便秘表现，而20mg、25mg、30mg组症状出现更早，但后期会出现动物死亡。造模过程中还发现，15mg组以上大鼠出现脱毛（严重者可见大片红色皮肤，以腹部最明显）、小便不畅、尿血、畏寒、蜷缩、消瘦等与中医肾虚证候类似症状，其是否符合中医肾虚便秘证候模型，还有待于进一步的研究探索。

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